Mikrotransplantation af synaptiske membraner til genaktivering af humane synaptiske receptorer til funktionelle undersøgelser

Summary

Protokollen viser, at ved at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter er det muligt at registrere konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre og γ-aminosmørsyrereceptorer.

Abstract

Excitatoriske og hæmmende ionotrope receptorer er de vigtigste porte af ionfluxer, der bestemmer aktiviteten af synapser under fysiologisk neuronal kommunikation. Derfor er ændringer i deres overflod, funktion og forhold til andre synaptiske elementer blevet observeret som en vigtig korrelation af ændringer i hjernefunktion og kognitiv svækkelse i neurodegenerative sygdomme og psykiske lidelser. At forstå, hvordan funktionen af excitatoriske og hæmmende synaptiske receptorer ændres af sygdom, er af afgørende betydning for udviklingen af effektive terapier. For at få sygdomsrelevant information er det vigtigt at registrere den elektriske aktivitet af neurotransmitterreceptorer, der forbliver funktionelle i den syge menneskelige hjerne. Indtil videre er dette den nærmeste tilgang til vurdering af patologiske ændringer i receptorernes funktion. I dette arbejde præsenteres en metode til at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner, som består i at reaktivere synaptiske membraner fra snapfrosset humant hjernevæv indeholdende humane receptorer ved injektion og posterior fusion i membranen af Xenopus laevis oocytter. Protokollen giver også den metodologiske strategi for at opnå konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) receptorer samt nye detaljerede metoder, der anvendes til normalisering og streng dataanalyse.

Introduction

Neurodegenerative lidelser påvirker en stor procentdel af befolkningen. Selvom deres ødelæggende konsekvenser er velkendte, er forbindelsen mellem de funktionelle ændringer af neurotransmitterreceptorer, som er kritiske for hjernens funktion, og deres symptomatologi stadig dårligt forstået. Interindividuel variation, sygdommens kroniske karakter og snigende symptomdebut er blot nogle af de årsager, der har forsinket forståelsen af de mange hjernesygdomme, hvor kemiske ubalancer er veldokumenterede ^1,2. Dyremodeller har genereret uvurderlig information og udvidet vores viden om de mekanismer, der ligger til grund for fysiologi og patofysiologi i evolutionære bevarede systemer; imidlertid udelukker flere interspecies forskelle mellem gnavere og mennesker den direkte ekstrapolering af receptorfunktionen fra dyremodeller til den menneskelige hjerne³. Således blev de indledende bestræbelser på at studere indfødte humane receptorer udviklet af Ricardo Miledis laboratorium ved hjælp af kirurgisk fjernet væv og frosne prøver. Disse indledende eksperimenter anvendte hele membraner, der inkluderer neuronale synaptiske og ekstra synaptiske receptorer samt ikke-neuronale neurotransmitterreceptorer, og selvom de giver vigtige oplysninger om syge tilstande, er der bekymring for, at blandingen af receptorer komplicerer fortolkningen af data 4,5,6,7. Det er vigtigt, at synapser er det vigtigste mål i mange neurodegenerative lidelser ^8,9; derfor er assays for at teste de funktionelle egenskaber af berørte synapser grundlæggende for at få information om sygdomsrelevante ændringer, der påvirker synaptisk kommunikation. Her beskrives en modifikation af den oprindelige metode: mikrotransplantation af synaptiske membraner (MSM), der fokuserer på den fysiologiske karakterisering af berigede synaptiske proteinpræparater og med succes er blevet anvendt til at studere rotte- og humane synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metode er det muligt at transplantere synaptiske receptorer, der engang arbejdede i den menneskelige hjerne, indlejret i deres egne indfødte lipider og med deres egen kohorte af associerede proteiner. Da MSM-data er kvantitative, er det desuden muligt at bruge disse data til at integrere med store proteomiske eller sekventerende datasæt¹⁰.

Det er vigtigt at bemærke, at mange farmakologiske og biofysiske analyser af synaptiske receptorer udføres på rekombinante proteiner^16,17. Mens denne tilgang giver bedre indsigt i receptorernes struktur-funktionsforhold, kan den ikke give information om komplekse multimere receptorkomplekser, der findes i neuroner og deres ændringer i sygdom. Derfor bør en kombination af indfødte og rekombinante proteiner give en mere omfattende analyse af synaptiske receptorer.

Der er mange metoder til at forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15, som kan justeres til kravene i et laboratorium. Protokollen begynder med antagelsen om, at synaptosomale berigede præparater blev isoleret og er klar til at blive behandlet til mikrotransplantationsforsøg. I laboratoriet anvendes Syn-Per-metoden efter producentens anvisninger. Dette gøres på grund af høj reproducerbarhed i elektrofysiologiske eksperimenter ^10,11. Der er også rigelig litteratur, der forklarer, hvordan man isolerer Xenopus oocytter^18,19, som også kan købes klar til injektion²⁰.

Protocol

Al forskning udføres i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og godkendes af det institutionelle animal care and use committee ved University of California Irvine (IACUC-1998-1388) og University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporal cortex fra en ikke-Alzheimers sygdom (AD) hjerne (kvinde, 74 år gammel, postmortem interval 2,8 h) og en AD-hjerne (kvinde, 74 år gammel, postmortem interval 4,5 h) blev leveret af University of California Irvine Alzheimers sygdom forskningscenter (UCI-ADRC). Info…

Representative Results

Inden for få timer efter injektion begynder de synaptiske membraner, der bærer deres neurotransmitterreceptorer og ionkanaler, at smelte sammen med oocytplasmamembranen. Figur 1 viser optagelser af AMPA- og GABAA-receptorer mikrotransplantet til Xenopus-oocytter. For det meste af analysen blev svarene fra to eller tre oocytter pr. prøve målt ved hjælp af to eller tre batcher oocytter fra forskellige frøer, i alt seks til ni oocytter pr. Prøve. Dette gøres for en s…

Discussion

Analyse af indfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for at forstå homeostatiske og patologiske processer i hjernesygdomme og udvikle terapeutiske strategier til forebyggelse eller behandling af sygdomme. Hjernebanker, der indeholder snapfrosne prøver, er således en uvurderlig kilde til et stort og for det meste uudnyttet væld af fysiologisk information^29,30. En indledende bekymring for at bruge postmortemvæv er den klare mulighed fo…

Materials

For Microinjection
3.5" Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate	Thermofisher	FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller	Sutter	P-1000
Injection Dish	Thermofisher	08-772B
Microcentrifuge Tubes	Thermofisher	02-682-002
Mineral Oil	Thermofisher	O121-1
Nanoject II	Drummond	3-000-204
Nylon mesh	Industrial Netting	WN0800
Parafilm	Thermofisher	S37440
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Syringe	Thermofisher	14-841-31
Ultrasonic cleaning bath	Thermofisher	FS20D
Xenopus laevis frogs	Xenopus 1	4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries	Sutter	B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter	Warner Instruments	LPF-8
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation	Warner Instruments	TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller	Automate Scientific	SKU:01-18
WInEDR Free software	University of Strathclyde Glasgow	https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ	National Instruments	NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride	Thermofisher	C79
Calcium nitrate tetrahydrate	Thermofisher	C109
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Thermofisher	BP310
Kainic acid	Tocris	0222
Magnesium sulfate heptahydrate	Thermofisher	M63
Potassium chloride	Thermofisher	P217
Sodium bicarbonate	Thermofisher	S233
Sodium chloride	Thermofisher	S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter,	Amicon