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Neuroscience

기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/64024
, , ,
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology,University of Texas Medical Branch

Summary

이 프로토콜은 Xenopus laevis 난모세포로 시냅스 막의 미세 이식을 수행함으로써 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 및 γ-아미노부티르산 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 기록할 수 있음을 입증한다.

Abstract

흥분성 및 억제성 이온성 수용체는 생리적 뉴런 소통 동안 시냅스의 활성을 결정하는 이온 플럭스의 주요 게이트이다. 따라서 다른 시냅스 요소와의 풍부함, 기능 및 관계의 변화는 신경 퇴행성 질환 및 정신 장애의 뇌 기능 및인지 장애의 주요 상관 관계로 관찰되었습니다. 흥분성 및 억제성 시냅스 수용체의 기능이 질병에 의해 어떻게 변화되는지를 이해하는 것은 효과적인 치료법의 개발을 위해 매우 중요하다. 질병 관련 정보를 얻으려면 병든 인간의 뇌에서 기능적으로 남아있는 신경 전달 물질 수용체의 전기 활동을 기록하는 것이 중요합니다. 지금까지 이것은 수용체 기능의 병리학 적 변화를 평가하는 가장 가까운 접근법입니다. 이 연구에서는 Xenopus laevis 난모세포의 막으로의 주사 및 후부 융합에 의해 인간 수용체를 포함하는 스냅 얼어 붙은 인간 뇌 조직에서 시냅스 막을 재활성화시키는 것으로 구성된 시냅스 막의 미세 이식을 수행하는 방법론이 제시됩니다. 이 프로토콜은 또한 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 및 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 얻기 위한 방법론적 전략뿐만 아니라 정상화 및 엄격한 데이터 분석에 사용되는 새로운 상세한 방법을 제공한다.

Introduction

신경 퇴행성 장애는 인구의 많은 비율에 영향을 미칩니다. 그들의 파괴적인 결과는 잘 알려져 있지만, 뇌 기능에 중요한 신경 전달 물질 수용체의 기능적 변화와 증상 사이의 연관성은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 개인 간 변동성, 질병의 만성 특성 및 교활한 증상 발병은 화학적 불균형이 잘 문서화 된 많은 뇌 질환에 대한 이해를 지연시킨 이유 중 일부일뿐입니다 1,2. 동물 모델은 귀중한 정보를 생성하고 진화 보존 시스템에서 생리학 및 병리 생리학의 기초가되는 메커니즘에 대한 지식을 확장했습니다. 그러나 설치류와 인간 사이의 여러 종 간 차이는 동물 모델에서 인간의 뇌로 수용체 기능의 직접적인 외삽을 배제합니다3. 따라서, 천연 인간 수용체를 연구하기 위한 초기 노력은 Ricardo Miledi의 실험실에서 외과적으로 제거된 조직과 동결된 샘플을 사용하여 개발되었다. 이 초기 실험은 신경 시냅스 및 여분의 시냅스 수용체뿐만 아니라 비 신경 전달 물질 수용체를 포함하는 전체 막을 사용했으며, 병든 상태에 대한 중요한 정보를 제공하지만 수용체의 혼합이 데이터 4,5,6,7의 해석을 복잡하게 만들 우려가 있습니다. 중요하게도, 시냅스는 많은 신경퇴행성 장애에서 주요 표적이다 8,9; 따라서 영향을받는 시냅스의 기능적 특성을 테스트하기위한 분석은 시냅스 통신에 영향을 미치는 질병 관련 변화에 대한 정보를 얻는 데 필수적입니다. 여기에서, 원래의 방법의 변형이 기술된다 : 시냅스 막 (MSM)의 미세 이식은 풍부한 시냅스 단백질 제제의 생리적 특성화에 중점을두고 쥐와 인간 시냅토좀 연구에 성공적으로 적용되었습니다10,11,12,13,14,15 . 이 방법론을 사용하면 한때 인간의 뇌에서 작동했던 시냅스 수용체를 이식 할 수 있으며, 자신의 고유 지질 및 관련 단백질의 자체 코호트에 묻혀 있습니다. 더욱이, MSM 데이터가 정량적이기 때문에, 이 데이터를 사용하여 큰 프로테오믹 또는 시퀀싱 데이터세트(10)와 통합할 수 있다.

시냅스 수용체의 많은 약리학 적 및 생물 물리학 적 분석이 재조합 단백질16,17에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 수용체의 구조 – 기능 관계에 대한 더 나은 통찰력을 제공하지만, 뉴런에서 발견되는 복잡한 다량체 수용체 복합체 및 질병의 변화에 대한 정보를 제공 할 수는 없습니다. 따라서, 천연 및 재조합 단백질의 조합은 시냅스 수용체에 대한보다 포괄적 인 분석을 제공해야합니다.

실험실의 요구 사항에 맞게 조정할 수있는 시냅토좀 10,11,12,13,13,14,15를 준비하는 많은 방법이 있습니다. 이 프로토콜은 시냅토좀 농축 제제가 분리되었고 미세이식 실험을 위해 처리 될 준비가되었다는 가정으로 시작됩니다. 실험실에서는 Syn-Per 메서드가 제조업체 지침에 따라 사용됩니다. 이것은 전기생리학적 실험10,11에서 높은 재현성 때문에 행해진다. 또한 제노푸스 난모세포(18,19)를 분리하는 방법을 설명하는 풍부한 문헌이 있으며, 이는 또한 주사 준비(20)를 위해 구입될 수 있다.

Protocol

모든 연구는 제도적 지침을 준수하여 수행되며 캘리포니아 어바인 대학 (IACUC-1998-1388)과 텍사스 대학 의료 지부 (IACUC-1803024)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비알츠하이머병(AD) 뇌(여성, 74세, 사후 간격 2.8 h) 및 AD-뇌(여성, 74세, 사후 간격 4.5 h)로부터의 측두엽 피질은 캘리포니아 대학교 어바인 알츠하이머병 연구 센터(UCI-ADRC)에 의해 제공되었다. 뇌 기증에 대한 정보에 입각…

Representative Results

주사 후 몇 시간 이내에 신경 전달 물질 수용체와 이온 채널을 운반하는 시냅스 막이 난모세포 원형질막과 융합되기 시작합니다. 도 1은 제노푸스 난모세포 내로 미세이식된 AMPA 및 GABAA 수용체의 기록을 보여준다. 대부분의 분석을 위해, 샘플 당 두 개 또는 세 개의 난모세포로부터의 반응을 측정하고, 샘플 당 총 여섯 개에서 아홉 개의 난모세포에 대해 서로 ?…

Discussion

인간 뇌의 천연 단백질 복합체 분석은 뇌 장애의 항상성 및 병리학 적 과정을 이해하고 질병을 예방하거나 치료하기위한 치료 전략을 개발하는 데 필요합니다. 따라서, 스냅 냉동 샘플을 함유하는 뇌 은행은 크고 대부분 미개척된 풍부한 생리학적 정보(29,30)의 귀중한 공급원이다. 사후 조직을 사용하는 초기 관심사는 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 NIA / NIH 보조금 R01AG070255 및 R01AG073133을 AL에 의해 지원되었습니다. 우리는 또한이 원고에 표시된 인간 조직을 제공 한 캘리포니아 어바인 알츠하이머 병 연구 센터 (UCI-ADRC)에 감사드립니다. UCI-ADRC는 NIH/NIA 보조금 P30 AG066519가 지원합니다.

Materials

For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon
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References

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Keywords: MicrotransplantationSynaptic MembranesSynaptic ReceptorsFunctional StudiesNeurodegenerative DisordersMental Health DisordersSynaptic CommunicationSynaptic ReceptorsBrain ReceptorsReceptor FunctionalityReceptor ChangesReceptor ActivityInjectionNanoinjectorOocytesSample PreparationSonicationThermoplasticManipulatorFoot PedalPetri DishControl Group
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Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).
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