Mikrotransplantation synaptischer Membranen zur Reaktivierung humaner synaptischer Rezeptoren für funktionelle Studien
Summary
Das Protokoll zeigt, dass es durch die Durchführung einer Mikrotransplantation synaptischer Membranen in Xenopus laevis-Eizellen möglich ist, konsistente und zuverlässige Reaktionen von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure- und γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren aufzuzeichnen.
Abstract
Erregende und inhibitorische ionotrope Rezeptoren sind die Haupttore der Ionenflüsse, die die Aktivität von Synapsen während der physiologischen neuronalen Kommunikation bestimmen. Daher wurden Veränderungen in ihrer Häufigkeit, Funktion und Beziehung zu anderen synaptischen Elementen als ein Hauptkorrelat von Veränderungen der Gehirnfunktion und kognitiven Beeinträchtigungen bei neurodegenerativen Erkrankungen und psychischen Störungen beobachtet. Zu verstehen, wie die Funktion von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Rezeptoren durch Krankheit verändert wird, ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung wirksamer Therapien. Um krankheitsrelevante Informationen zu gewinnen, ist es wichtig, die elektrische Aktivität von Neurotransmitterrezeptoren aufzuzeichnen, die im erkrankten menschlichen Gehirn funktionsfähig bleiben. Bisher ist dies der nächstliegende Ansatz, um pathologische Veränderungen in der Funktion von Rezeptoren zu beurteilen. In dieser Arbeit wird eine Methodik vorgestellt, um eine Mikrotransplantation von synaptischen Membranen durchzuführen, die darin besteht, synaptische Membranen aus eingefrorenem menschlichem Hirngewebe, das menschliche Rezeptoren enthält, durch Injektion und posteriore Fusion in die Membran von Xenopus laevis-Eizellen zu reaktivieren. Das Protokoll bietet auch die methodische Strategie, um konsistente und zuverlässige Antworten auf α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) und γ-Aminobuttersäure (GABA) -Rezeptoren zu erhalten, sowie neuartige detaillierte Methoden, die für die Normalisierung und rigorose Datenanalyse verwendet werden.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen betreffen einen großen Prozentsatz der Bevölkerung. Obwohl ihre verheerenden Folgen bekannt sind, ist der Zusammenhang zwischen den funktionellen Veränderungen der Neurotransmitterrezeptoren, die für die Gehirnfunktion entscheidend sind, und ihrer Symptomatologie noch wenig verstanden. Interindividuelle Variabilität, chronische Natur der Krankheit und schleichendes Auftreten von Symptomen sind nur einige der Gründe, die das Verständnis der vielen Gehirnstörungen verzögert haben, bei denen chemische Ungleichgewichte gut dokumentiert sind 1,2. Tiermodelle haben unschätzbare Informationen generiert und unser Wissen über die Mechanismen, die der Physiologie und Pathophysiologie in evolutionär konservierten Systemen zugrunde liegen, erweitert; Mehrere Interspeziesunterschiede zwischen Nagetieren und Menschen schließen jedoch die direkte Extrapolation der Rezeptorfunktion aus Tiermodellen auf das menschliche Gehirnaus 3 aus. Daher wurden erste Bemühungen, native menschliche Rezeptoren zu untersuchen, vom Labor von Ricardo Miledi mit chirurgisch entferntem Gewebe und gefrorenen Proben entwickelt. Diese ersten Experimente verwendeten ganze Membranen, die neuronale synaptische und extrasynaptische Rezeptoren sowie nicht-neuronale Neurotransmitterrezeptoren enthalten, und obwohl sie wichtige Informationen über erkrankte Zustände liefern, besteht die Sorge, dass die Mischung der Rezeptoren die Interpretation der Daten 4,5,6,7 erschwert. Wichtig ist, dass Synapsen das Hauptziel bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen sind 8,9; Daher sind Assays zum Testen der funktionellen Eigenschaften betroffener Synapsen von grundlegender Bedeutung, um Informationen über krankheitsrelevante Veränderungen zu erhalten, die die synaptische Kommunikation beeinflussen. Hier wird eine Modifikation der ursprünglichen Methode beschrieben: Mikrotransplantation synaptischer Membranen (MSM), die sich auf die physiologische Charakterisierung angereicherter synaptischer Proteinpräparate konzentriert und erfolgreich zur Untersuchung von Ratten- und Humansynaptosomen angewendet wurde 10,11,12,13,14,15 . Mit dieser Methodik ist es möglich, synaptische Rezeptoren, die einst im menschlichen Gehirn arbeiteten, zu transplantieren, eingebettet in ihre eigenen nativen Lipide und mit ihrer eigenen Kohorte assoziierter Proteine. Da MSM-Daten quantitativ sind, ist es außerdem möglich, diese Daten für die Integration in große Proteomik- oder Sequenzierungsdatensätze10 zu verwenden.
Es ist wichtig zu beachten, dass viele pharmakologische und biophysikalische Analysen von synaptischen Rezeptoren an rekombinanten Proteinendurchgeführt werden 16,17. Während dieser Ansatz einen besseren Einblick in die Struktur-Funktions-Beziehungen von Rezeptoren bietet, kann er keine Informationen über komplexe multimere Rezeptorkomplexe in Neuronen und deren Krankheitsveränderungen liefern. Daher sollte eine Kombination aus nativen und rekombinanten Proteinen eine umfassendere Analyse der synaptischen Rezeptoren ermöglichen.
Es gibt viele Methoden, um Synaptosomen 10,11,12,13,14,15 herzustellen, die an die Anforderungen eines Labors angepasst werden können. Das Protokoll beginnt mit der Annahme, dass synaptosomal angereicherte Präparate isoliert wurden und bereit sind, für Mikrotransplantationsexperimente verarbeitet zu werden. Im Labor wird die Syn-Per-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers angewendet. Dies geschieht aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit in elektrophysiologischen Experimenten10,11. Es gibt auch reichlich Literatur, die erklärt, wie man Xenopus-Eizellen 18,19 isoliert, die auch injektionsfertigerworben werden können 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse nativer Proteinkomplexe aus dem menschlichen Gehirn ist erforderlich, um homöostatische und pathologische Prozesse bei Hirnerkrankungen zu verstehen und therapeutische Strategien zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten zu entwickeln. So sind Gehirnbanken, die eingefrorene Proben enthalten, eine unschätzbare Quelle für einen großen und meist ungenutzten Reichtum physiologischer Informationen29,30. Ein erstes Anliegen bei der Verwendung von p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIA/NIH-Zuschüsse R01AG070255 und R01AG073133 an AL unterstützt. Wir danken auch dem Alzheimer-Forschungszentrum der University of California Irvine (UCI-ADRC) für die Bereitstellung des in diesem Manuskript gezeigten menschlichen Gewebes. Das UCI-ADRC wird durch den NIH/NIA-Zuschuss P30 AG066519 finanziert.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
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