Summary

Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles

Published: July 20, 2022
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Summary

Le protocole démontre qu’en effectuant une microtransplantation de membranes synaptiques en ovocytes Xenopus laevis , il est possible d’enregistrer des réponses cohérentes et fiables de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique et des récepteurs de l’acide γ-aminobutyrique.

Abstract

Les récepteurs ionotropes excitateurs et inhibiteurs sont les principales portes des flux ioniques qui déterminent l’activité des synapses au cours de la communication neuronale physiologique. Par conséquent, des altérations de leur abondance, de leur fonction et de leurs relations avec d’autres éléments synaptiques ont été observées comme un corrélat majeur des altérations de la fonction cérébrale et des troubles cognitifs dans les maladies neurodégénératives et les troubles mentaux. Comprendre comment la fonction des récepteurs synaptiques excitateurs et inhibiteurs est altérée par la maladie est d’une importance cruciale pour le développement de thérapies efficaces. Pour obtenir des informations pertinentes pour la maladie, il est important d’enregistrer l’activité électrique des récepteurs de neurotransmetteurs qui restent fonctionnels dans le cerveau humain malade. Jusqu’à présent, il s’agit de l’approche la plus proche pour évaluer les altérations pathologiques de la fonction des récepteurs. Dans ce travail, une méthodologie est présentée pour effectuer la microtransplantation de membranes synaptiques, qui consiste à réactiver des membranes synaptiques à partir de tissus cérébraux humains congelés contenant des récepteurs humains, par son injection et sa fusion postérieure dans la membrane des ovocytes Xenopus laevis . Le protocole fournit également la stratégie méthodologique pour obtenir des réponses cohérentes et fiables des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et de l’acide γ-aminobutyrique (GABA), ainsi que de nouvelles méthodes détaillées utilisées pour la normalisation et l’analyse rigoureuse des données.

Introduction

Les troubles neurodégénératifs affectent un grand pourcentage de la population. Bien que leurs conséquences dévastatrices soient bien connues, le lien entre les altérations fonctionnelles des récepteurs des neurotransmetteurs, qui sont essentiels au fonctionnement du cerveau, et leur symptomatologie est encore mal compris. La variabilité interindividuelle, la nature chronique de la maladie et l’apparition insidieuse des symptômes ne sont que quelques-unes des raisons qui ont retardé la compréhension des nombreux troubles cérébraux où les déséquilibres chimiques sont bien documentés 1,2. Les modèles animaux ont généré des informations inestimables et élargi nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents à la physiologie et à la physiopathologie dans les systèmes évolutifs conservés; cependant, plusieurs différences interespèces entre les rongeurs et les humains empêchent l’extrapolation directe de la fonction des récepteurs des modèles animaux au cerveau humain3. Ainsi, les premiers efforts pour étudier les récepteurs humains natifs ont été développés par le laboratoire de Ricardo Miledi en utilisant des tissus enlevés chirurgicalement et des échantillons congelés. Ces expériences initiales ont utilisé des membranes entières qui comprennent des récepteurs synaptiques et extra synaptiques neuronaux ainsi que des récepteurs de neurotransmetteurs non neuronaux, et bien qu’elles fournissent des informations importantes sur les états malades, on craint que le mélange de récepteurs ne complique l’interprétation des données 4,5,6,7. Il est important de noter que les synapses sont la cible principale de nombreux troubles neurodégénératifs 8,9; par conséquent, les tests pour tester les propriétés fonctionnelles des synapses affectées sont fondamentaux pour obtenir des informations sur les changements pertinents pour la maladie affectant la communication synaptique. Ici, une modification de la méthode originale est décrite: la microtransplantation des membranes synaptiques (MSM), qui se concentre sur la caractérisation physiologique des préparations de protéines synaptiques enrichies et a été appliquée avec succès à l’étude des synaptosomes 10,11,12,13,14,15 . Avec cette méthodologie, il est possible de transplanter des récepteurs synaptiques qui travaillaient autrefois dans le cerveau humain, intégrés dans leurs propres lipides natifs et avec leur propre cohorte de protéines associées. De plus, comme les données des HARSAH sont quantitatives, il est possible d’utiliser ces données pour les intégrer à de grands ensembles de données protéomiques ou de séquençage10.

Il est important de noter que de nombreuses analyses pharmacologiques et biophysiques des récepteurs synaptiques sont effectuées sur des protéines recombinantes16,17. Bien que cette approche fournisse un meilleur aperçu des relations structure-fonction des récepteurs, elle ne peut pas fournir d’informations sur les complexes complexes de récepteurs multimériques trouvés dans les neurones et leurs changements dans la maladie. Par conséquent, une combinaison de protéines natives et recombinantes devrait fournir une analyse plus complète des récepteurs synaptiques.

Il existe de nombreuses méthodes pour préparer les synaptosomes 10,11,12,13,14,15 qui peuvent être ajustés pour les besoins d’un laboratoire. Le protocole part de l’hypothèse que les préparations enrichies en synaptomoses ont été isolées et sont prêtes à être traitées pour des expériences de microtransplantation. En laboratoire, la méthode Syn-Per est utilisée en suivant les instructions du fabricant. Ceci est fait en raison de la reproductibilité élevée dans les expériences électrophysiologiques10,11. Il existe également une abondante littérature expliquant comment isoler les ovocytes Xenopus 18,19, qui peuvent également être achetés prêts pour l’injection20.

Protocol

Toutes les recherches sont effectuées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Irvine (IACUC-1998-1388) et de la branche médicale de l’Université du Texas (IACUC-1803024). Le cortex temporal d’un cerveau non atteint de la maladie d’Alzheimer (MA) (femme, 74 ans, intervalle post-mortem 2,8 h) et d’un cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer (femme, 74 ans, intervalle post-mortem 4,5 …

Representative Results

Quelques heures après l’injection, les membranes synaptiques, porteuses de leurs récepteurs de neurotransmetteurs et de leurs canaux ioniques, commencent à fusionner avec la membrane plasmique de l’ovocyte. La figure 1 montre des enregistrements des récepteurs AMPA et GABAA microtransplantés en ovocytes Xenopus. Pour la majeure partie de l’analyse, les réponses de deux ou trois ovocytes par échantillon ont été mesurées, en utilisant deux ou trois lots d’…

Discussion

L’analyse des complexes protéiques natifs du cerveau humain est nécessaire pour comprendre les processus homéostatiques et pathologiques dans les troubles cérébraux et développer des stratégies thérapeutiques pour prévenir ou traiter les maladies. Ainsi, les banques de cerveaux contenant des échantillons congelés instantanément sont une source inestimable d’une grande richesse d’informations physiologiques, pour la plupart inexploitée 29,30. Un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions NIA/NIH R01AG070255 et R01AG073133 à AL. Nous remercions également le centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer de l’Université de Californie à Irvine (UCI-ADRC) d’avoir fourni le tissu humain présenté dans ce manuscrit. L’UCI-ADRC est financé par la subvention NIH/NIA P30 AG066519.

Materials

For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

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Cite This Article
Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

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