Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales
Summary
El protocolo demuestra que mediante la realización de microtrasplante de membranas sinápticas en ovocitos de Xenopus laevis , es posible registrar respuestas consistentes y confiables de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico y los receptores de ácido γ-aminobutírico.
Abstract
Los receptores ionotrópicos excitatorios e inhibitorios son las principales puertas de los flujos iónicos que determinan la actividad de las sinapsis durante la comunicación neuronal fisiológica. Por lo tanto, las alteraciones en su abundancia, función y relaciones con otros elementos sinápticos se han observado como un correlato importante de alteraciones en la función cerebral y deterioro cognitivo en enfermedades neurodegenerativas y trastornos mentales. Comprender cómo la función de los receptores sinápticos excitatorios e inhibitorios se ve alterada por la enfermedad es de importancia crítica para el desarrollo de terapias efectivas. Para obtener información relevante para la enfermedad, es importante registrar la actividad eléctrica de los receptores de neurotransmisores que permanecen funcionales en el cerebro humano enfermo. Hasta ahora, este es el enfoque más cercano para evaluar las alteraciones patológicas en la función de los receptores. En este trabajo, se presenta una metodología para realizar el microtrasplante de membranas sinápticas, que consiste en reactivar las membranas sinápticas a partir de tejido cerebral humano congelado por snap que contiene receptores humanos, mediante su inyección y posterior fusión en la membrana de ovocitos de Xenopus laevis . El protocolo también proporciona la estrategia metodológica para obtener respuestas consistentes y confiables de los receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y ácido γ-aminobutírico (GABA), así como nuevos métodos detallados que se utilizan para la normalización y el análisis riguroso de datos.
Introduction
Los trastornos neurodegenerativos afectan a un gran porcentaje de la población. Aunque sus consecuencias devastadoras son bien conocidas, el vínculo entre las alteraciones funcionales de los receptores de neurotransmisores, que son críticos para la función cerebral, y su sintomatología aún no se conoce bien. La variabilidad interindividual, la naturaleza crónica de la enfermedad y la aparición insidiosa de los síntomas son solo algunas de las razones que han retrasado la comprensión de los muchos trastornos cerebrales donde los desequilibrios químicos están bien documentados 1,2. Los modelos animales han generado información invaluable y ampliado nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la fisiología y la fisiopatología en los sistemas evolutivos conservados; sin embargo, varias diferencias entre especies entre roedores y humanos impiden la extrapolación directa de la función del receptor de modelos animales al cerebro humano3. Por lo tanto, los esfuerzos iniciales para estudiar los receptores humanos nativos fueron desarrollados por el laboratorio de Ricardo Miledi utilizando tejido extirpado quirúrgicamente y muestras congeladas. Estos experimentos iniciales utilizaron membranas enteras que incluyen receptores sinápticos neuronales y sinápticos adicionales, así como receptores de neurotransmisores no neuronales, y aunque proporcionan información importante sobre los estados enfermos, existe la preocupación de que la mezcla de receptores complique la interpretación de los datos 4,5,6,7. Es importante destacar que las sinapsis son el objetivo principal en muchos trastornos neurodegenerativos 8,9; por lo tanto, los ensayos para probar las propiedades funcionales de las sinapsis afectadas son fundamentales para obtener información sobre los cambios relevantes para la enfermedad que afectan la comunicación sináptica. Aquí, se describe una modificación del método original: microtrasplante de membranas sinápticas (MSM), que se centra en la caracterización fisiológica de preparaciones de proteínas sinápticas enriquecidas y se ha aplicado con éxito para estudiar sinaptosomas de ratas y humanos 10,11,12,13,14,15 . Con esta metodología, es posible trasplantar receptores sinápticos que alguna vez estuvieron trabajando en el cerebro humano, incrustados en sus propios lípidos nativos y con su propia cohorte de proteínas asociadas. Además, debido a que los datos de HSH son cuantitativos, es posible utilizar estos datos para integrarse con grandes conjuntos de datos proteómicos o de secuenciación10.
Es importante señalar que muchos análisis farmacológicos y biofísicos de los receptores sinápticos se realizan sobre proteínas recombinantes16,17. Si bien este enfoque proporciona una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los receptores, no puede proporcionar información sobre complejos de receptores multiméricos que se encuentran en las neuronas y sus cambios en la enfermedad. Por lo tanto, una combinación de proteínas nativas y recombinantes debería proporcionar un análisis más completo de los receptores sinápticos.
Hay muchos métodos para preparar sinaptosomas 10,11,12,13,14,15 que se pueden ajustar a los requisitos de un laboratorio. El protocolo comienza con la suposición de que las preparaciones enriquecidas con sinaptosomal fueron aisladas y están listas para ser procesadas para experimentos de microtrasplante. En el laboratorio, el método Syn-Per se utiliza siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto se hace debido a la alta reproducibilidad en experimentos electrofisiológicos10,11. También existe abundante literatura que explica cómo aislar los ovocitos de Xenopus 18,19, que también se pueden comprar listos para la inyección20.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de complejos de proteínas nativas de cerebros humanos es necesario para comprender los procesos homeostáticos y patológicos en los trastornos cerebrales y desarrollar estrategias terapéuticas para prevenir o tratar enfermedades. Por lo tanto, los bancos de cerebros que contienen muestras congeladas instantáneamente son una fuente invaluable de una gran riqueza de información fisiológica en su mayoría sin explotar29,30. Una preocupación inici…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01AG070255 y R01AG073133 A AL. También agradecemos al Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Irvine de la Universidad de California (UCI-ADRC) por proporcionar el tejido humano que se muestra en este manuscrito. El UCI-ADRC está financiado por la subvención NIH/NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
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