الزرع المجهري للأغشية المشبكية لإعادة تنشيط المستقبلات المشبكية البشرية للدراسات الوظيفية
Summary
يوضح البروتوكول أنه من خلال إجراء الزرع المجهري للأغشية المشبكية في بويضات Xenopus laevis ، من الممكن تسجيل استجابات متسقة وموثوقة α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid ومستقبلات حمض γ-aminobutyric.
Abstract
المستقبلات الأيونية المثيرة والمثبطة هي البوابات الرئيسية للتدفقات الأيونية التي تحدد نشاط نقاط الاشتباك العصبي أثناء التواصل العصبي الفسيولوجي. لذلك ، لوحظت تغيرات في وفرتها ووظيفتها وعلاقاتها مع العناصر المشبكية الأخرى كارتباط رئيسي للتغيرات في وظائف الدماغ والضعف المعرفي في الأمراض العصبية التنكسية والاضطرابات العقلية. إن فهم كيفية تغيير وظيفة المستقبلات المشبكية المثيرة والمثبطة بسبب المرض له أهمية حاسمة لتطوير علاجات فعالة. للحصول على معلومات ذات صلة بالمرض ، من المهم تسجيل النشاط الكهربائي لمستقبلات الناقل العصبي التي تظل تعمل في الدماغ البشري المريض. حتى الآن هذا هو النهج الأقرب لتقييم التغيرات المرضية في وظيفة المستقبلات. في هذا العمل ، يتم تقديم منهجية لإجراء الزرع المجهري للأغشية المشبكية ، والتي تتكون من إعادة تنشيط الأغشية المشبكية من أنسجة المخ البشرية المجمدة المفاجئة التي تحتوي على مستقبلات بشرية ، عن طريق حقنها ودمجها الخلفي في غشاء بويضات Xenopus laevis . ويوفر البروتوكول أيضا الاستراتيجية المنهجية للحصول على استجابات متسقة وموثوقة لمستقبلات α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) ومستقبلات حمض γ-aminobutyric (GABA)، فضلا عن طرق مفصلة جديدة تستخدم للتطبيع والتحليل الدقيق للبيانات.
Introduction
تؤثر الاضطرابات العصبية التنكسية على نسبة كبيرة من السكان. على الرغم من أن عواقبها المدمرة معروفة جيدا ، إلا أن العلاقة بين التغيرات الوظيفية لمستقبلات الناقل العصبي ، والتي تعتبر حاسمة لوظائف الدماغ ، وأعراضها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. التباين بين الأفراد ، والطبيعة المزمنة للمرض ، وظهور الأعراض الخبيثة ليست سوى بعض الأسباب التي أخرت فهم العديد من اضطرابات الدماغ حيث يتم توثيق الاختلالات الكيميائية بشكل جيد 1,2. وقد ولدت النماذج الحيوانية معلومات لا تقدر بثمن ووسعت معرفتنا حول الآليات الكامنة وراء علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية في النظم التطورية المحفوظة. ومع ذلك ، فإن العديد من الاختلافات بين الأنواع بين القوارض والبشر تمنع الاستقراء المباشر لوظيفة المستقبلات من النماذج الحيوانية إلى الدماغ البشري3. وهكذا ، تم تطوير الجهود الأولية لدراسة المستقبلات البشرية الأصلية من قبل مختبر ريكاردو ميليدي باستخدام الأنسجة التي تمت إزالتها جراحيا والعينات المجمدة. استخدمت هذه التجارب الأولية أغشية كاملة تشمل مستقبلات مشبكية عصبية ومستقبلات مشبكية إضافية بالإضافة إلى مستقبلات ناقل عصبي غير عصبي ، وعلى الرغم من أنها توفر معلومات مهمة حول الحالات المريضة ، إلا أن هناك قلقا من أن مزيج المستقبلات يعقد تفسير البيانات4،5،6،7. الأهم من ذلك ، نقاط الاشتباك العصبي هي الهدف الرئيسي في العديد من الاضطرابات العصبية التنكسية 8,9; لذلك ، تعد المقايسات لاختبار الخصائص الوظيفية للمشابك العصبية المصابة أساسية للحصول على معلومات حول التغيرات ذات الصلة بالمرض التي تؤثر على التواصل المشبكي. هنا ، يتم وصف تعديل الطريقة الأصلية: الزرع المجهري للأغشية المشبكية (MSM) ، والذي يركز على التوصيف الفسيولوجي لمستحضرات البروتين المشبكي المخصب وتم تطبيقه بنجاح لدراسة المشابك العصبية للفئران والبشر 10،11،12،13،14،15 . باستخدام هذه المنهجية ، من الممكن زرع مستقبلات متشابكة كانت تعمل ذات يوم في الدماغ البشري ، مدمجة في الدهون الأصلية الخاصة بها ومع مجموعتها الخاصة من البروتينات المرتبطة بها. علاوة على ذلك ، نظرا لأن بيانات MSM كمية ، فمن الممكن استخدام هذه البيانات للتكامل مع مجموعات بيانات البروتينية أو التسلسل الكبيرة10.
من المهم ملاحظة أن العديد من التحليلات الدوائية والفيزيائية الحيوية للمستقبلات المشبكية تتم على البروتينات المؤتلفة16,17. في حين أن هذا النهج يوفر رؤية أفضل للعلاقات بين البنية والوظيفة للمستقبلات ، إلا أنه لا يمكنه توفير معلومات حول مجمعات المستقبلات المعقدة متعددة المراوغات الموجودة في الخلايا العصبية وتغيراتها في المرض. لذلك ، يجب أن يوفر مزيج من البروتينات الأصلية والمؤتلفة تحليلا أكثر شمولا للمستقبلات المتشابكة.
هناك العديد من الطرق لإعداد المشابك العصبية10،11،12،13،14،15 والتي يمكن تعديلها لمتطلبات المختبر. يبدأ البروتوكول بافتراض أن المستحضرات المخصب المشبك العصبي قد تم عزلها وجاهزة للمعالجة لتجارب الزرع المجهري. في المختبر، يتم استخدام طريقة Syn-Per باتباع إرشادات الشركة المصنعة. يتم ذلك بسبب القابلية العالية للتكرار في التجارب الكهروفسيولوجية10,11. هناك أيضا أدبيات وفيرة تشرح كيفية عزل بويضات Xenopus 18,19 ، والتي يمكن شراؤها أيضا جاهزة للحقن20.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة إلى تحليل مجمعات البروتين الأصلية من أدمغة البشر لفهم العمليات التماثلية والمرضية في اضطرابات الدماغ وتطوير استراتيجيات علاجية للوقاية من الأمراض أو علاجها. وبالتالي ، فإن بنوك الدماغ التي تحتوي على عينات مجمدة مفاجئة هي مصدر لا يقدر بثمن لثروة كبيرة وغير مستغلة في الغالب من ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح NIA / NIH R01AG070255 و R01AG073133 إلى AL. كما نشكر مركز أبحاث مرض الزهايمر بجامعة كاليفورنيا إيرفين (UCI-ADRC) على توفير الأنسجة البشرية الموضحة في هذه المخطوطة. يتم تمويل UCI-ADRC من خلال منحة NIH / NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
