Protokollen viser at ved å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter, er det mulig å registrere konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid og γ-aminosmørsyre reseptorer.
Eksitatoriske og hemmende ionotrope reseptorer er de viktigste portene til ionflukser som bestemmer aktiviteten til synapser under fysiologisk nevronkommunikasjon. Derfor har endringer i deres overflod, funksjon og forhold til andre synaptiske elementer blitt observert som en stor korrelasjon av endringer i hjernefunksjon og kognitiv svikt i nevrodegenerative sykdommer og psykiske lidelser. Å forstå hvordan funksjonen til eksitatoriske og hemmende synaptiske reseptorer endres av sykdom, er av avgjørende betydning for utviklingen av effektive terapier. For å få sykdomsrelevant informasjon er det viktig å registrere den elektriske aktiviteten til nevrotransmitterreseptorer som forblir funksjonelle i den syke menneskelige hjernen. Så langt er dette den nærmeste tilnærmingen til å vurdere patologiske endringer i reseptorens funksjon. I dette arbeidet presenteres en metodikk for å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner, som består av reaktivering av synaptiske membraner fra snapfrossen humant hjernevev som inneholder menneskelige reseptorer, ved injeksjon og bakre fusjon i membranen til Xenopus laevis oocytter. Protokollen gir også den metodologiske strategien for å oppnå konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) reseptorer, samt nye detaljerte metoder som brukes til normalisering og streng dataanalyse.
Nevrodegenerative lidelser påvirker en stor prosentandel av befolkningen. Selv om deres ødeleggende konsekvenser er velkjente, er koblingen mellom de funksjonelle endringene av nevrotransmitterreseptorer, som er kritiske for hjernefunksjonen, og symptomatologien deres fortsatt dårlig forstått. Inter-individuell variasjon, kronisk natur av sykdommen, og lumsk utbrudd av symptomer er bare noen av grunnene som har forsinket forståelsen av de mange hjernesykdommer der kjemiske ubalanser er godt dokumentert 1,2. Dyremodeller har generert uvurderlig informasjon og utvidet vår kunnskap om mekanismene underliggende fysiologi og patofysiologi i evolusjonære bevarte systemer; Imidlertid utelukker flere interspecies forskjeller mellom gnagere og mennesker direkte ekstrapolering av reseptorfunksjon fra dyremodeller til den menneskelige hjerne3. Dermed ble innledende innsats for å studere innfødte menneskelige reseptorer utviklet av Ricardo Miledis laboratorium ved hjelp av kirurgisk fjernet vev og frosne prøver. Disse første eksperimentene brukte hele membraner som inkluderer nevronal synaptiske og ekstra synaptiske reseptorer samt ikke-nevronale nevrotransmitterreseptorer, og selv om de gir viktig informasjon om syke tilstander, er det en bekymring for at blandingen av reseptorer kompliserer tolkningen av data 4,5,6,7. Viktigst, synapser er hovedmålet i mange nevrodegenerative lidelser 8,9; Derfor er analyser for å teste de funksjonelle egenskapene til berørte synapser grunnleggende for å få informasjon om sykdomsrelevante endringer som påvirker synaptisk kommunikasjon. Her er en modifikasjon av den opprinnelige metoden beskrevet: mikrotransplantasjon av synaptiske membraner (MSM), som fokuserer på fysiologisk karakterisering av berikede synaptiske proteinpreparater og har blitt brukt til å studere rotte og menneskelige synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metodikken er det mulig å transplantere synaptiske reseptorer som en gang jobbet i den menneskelige hjerne, innebygd i sine egne innfødte lipider og med sin egen kohort av tilknyttede proteiner. Fordi MSM-data er kvantitative, er det dessuten mulig å bruke disse dataene til å integrere med store proteomiske datasett eller sekvenseringsdatasett10.
Det er viktig å merke seg at mange farmakologiske og biofysiske analyser av synaptiske reseptorer gjøres på rekombinante proteiner 16,17. Selv om denne tilnærmingen gir bedre innsikt i strukturfunksjonsforholdene til reseptorer, kan den ikke gi informasjon om komplekse multimeriske reseptorkomplekser som finnes i nevroner og deres endringer i sykdom. Derfor bør en kombinasjon av innfødte og rekombinante proteiner gi en mer omfattende analyse av synaptiske reseptorer.
Det er mange metoder for å forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15 som kan justeres for kravene til et laboratorium. Protokollen begynner med antagelsen om at synaptosomale berikede preparater ble isolert og er klare til å bli behandlet for mikrotransplantasjonsforsøk. I laboratoriet brukes Syn-Per-metoden i henhold til produsentens instruksjoner. Dette gjøres på grunn av høy reproduserbarhet i elektrofysiologiske eksperimenter10,11. Det er også rikelig litteratur som forklarer hvordan man isolerer Xenopus oocytter18,19, som også kan kjøpes klar til injeksjon20.
Analyse av innfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for å forstå homeostatiske og patologiske prosesser i hjernesykdommer og utvikle terapeutiske strategier for å forebygge eller behandle sykdommer. Dermed er hjernebanker som inneholder snap frosne prøver en uvurderlig kilde til en stor og for det meste uutnyttet rikdom av fysiologisk informasjon29,30. En første bekymring for å bruke postmortem vev er den klare muligheten for mRNA …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIA/NIH tilskudd R01AG070255 og R01AG073133 til AL. Vi takker også University of California Irvine Alzheimers sykdomsforskningssenter (UCI-ADRC) for å ha gitt det menneskelige vevet som vises i dette manuskriptet. UCI-ADRC er finansiert av NIH/NIA grant P30 AG066519.
For Microinjection | |||
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
For Two Electrode Voltage clamp | |||
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
Any PC computer or laptop | |||
Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
Reagents | |||
Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
Kainic acid | Tocris | 0222 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |