Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב להגדרת מודל עור פצוע ex vivo ovine הנגוע בסטפילוקוקוס אאורוס. מודל תפוקה גבוהה זה מדמה טוב יותר זיהומים in vivo בהשוואה לטכניקות מיקרוביולוגיה קונבנציונליות ומציג לחוקרים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים.
Abstract
פיתוח של מיקרוביאלים הוא תהליך יקר עם שיעורי הצלחה נמוכים יותר ויותר, מה שהופך את ההשקעה הנוספת במחקר גילוי מיקרוביאלי לפחות אטרקטיבית. גילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות והמסחור שלאחר מכן יכולים להיות משתלמים יותר אם ניתן ליישם גישה של כישלון מהיר ונכשל בזול בשלבי אופטימיזציה של עופרת שבהם לחוקרים יש שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרופות. במאמר זה, ההגדרה של מודל עור פצוע ex vivo ovine נגוע Staphylococcus aureus מתואר, שהוא פשוט, חסכוני, תפוקה גבוהה, וניתן לשחזור. הפיזיולוגיה החיידקית במודל מחקה שבזמן ההדבקה התפשטות חיידקית תלויה ביכולתו של הפתוגן לפגוע ברקמה. הקמת זיהום הפצע מאומתת על ידי עלייה בספירת חיידקים קיימא בהשוואה לאינוקולום. מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים בשלב אופטימיזציה של עופרת. ניתן לטעון כי זמינותו של מודל זה תספק לחוקרים המפתחים חומרים אנטי-מיקרוביאליים מודל של כישלון-מהיר-וכישלון-זול, אשר יסייע להגדיל את שיעורי ההצלחה בניסויים הבאים בבעלי חיים. המודל גם יאפשר הפחתה ועידון של השימוש בבעלי חיים למחקר ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר וחסכוני יותר של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים לזיהומים בעור וברקמות רכות למרפאה.
Introduction
זיהומי עור הם נושא עולמי חשוב, עם עלויות כלכליות גדולות לספקי שירותי בריאות ברחבי העולם. הפיתוח של עמידות רב-תכליתית ויצירת ביופילם על ידי פתוגנים ממלא תפקיד מפתח בשכיחות של פצעים שאינם מחלימים 1,2,3,4. כתוצאה מכך, זיהומים בעור וברקמות רכות הם אחת הסיבות השכיחות יותר לאשפוז ממושך ולאחר מכן לאשפוז חוזר5. עיכובים בריפוי פצעים עולים ביוקר הן למטופלים והן לספקי שירותי הבריאות, כאשר חלק מההערכות גורסות כי כ-6.5 מיליון מטופלים נפגעים מדי שנה בארה"ב. בבריטניה, זיהומי עור וסיבוכים נלווים גורמים לכ-75,000 מקרי מוות בשנה 2,4,6.
סטפילוקוקוס אאורוס (S. aureus) הוא פתוגן פצע אימתני המבודד לעתים קרובות מפצעי מטופלים 2,7. קצב הופעתה של עמידות multidrug גדל באופן דרסטי בשנות ה -2000. במהלך תקופה זו, כ-60% מהזיהומים החריפים בעור ובמבנה העור היו חיוביים לתרבית עבור S. aureus1 העמיד למתיצילין. המספר ההולך וגדל של זנים עמידים למולטי-דרוג בקרב סטפילוקוקים, ואכן פתוגנים אחרים, במהלך 2 העשורים האחרונים מצביע על צורך דחוף בפיתוח מהיר של אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה חדשות שיכולות להתגבר על עמידות.
עם זאת, מאז תחילת שנות ה-2000, תוכניות גילוי אנטיביוטיקה נשלטו על ידי זמני התפתחות ארוכים יותר ושיעורי הצלחה נמוכים, כאשר רק 17% מהאנטיביוטיקה החדשנית שנכנסה לניסויים קליניים בארה"ב השיגה אישור שוק8. זה מצביע על פער בין התוצאות של בדיקות חוץ גופיות של אנטיביוטיקה מתפתחת לבין התוצאות הקליניות שלהן. ניתן לטעון כי פער זה נובע במידה רבה מהבדלים בפיזיולוגיה של חיידקים במהלך זיהומים in vivo ובמהלך שיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות בעת בדיקת היעילות של אנטיביוטיקה בשלבים הפרה-קליניים במבחנה . לכן, יש צורך בשיטות מעבדה חדשניות המייצגות יותר את הפיזיולוגיה של חיידקים במהלך ההדבקה כדי לשפר את שיעורי ההצלחה בתוכניות גילוי אנטיביוטיקה.
השיטות הנוכחיות לחקר זיהומי עור כוללות מחקרים בחיות חיות (למשל, עכברים), מודלים של עור ex vivo (למשל, חזיר), ומודלים תלת-ממדיים של עור מהונדסים על ידי רקמות (למשל, בני אדם)9,10,11,12. מחקרים בבעלי חיים חיים מוסדרים בקפדנות ובעלי תפוקה נמוכה יחסית. במודלים של בעלי חיים, פציעות וזיהומים גורמים למצוקה משמעותית לבעלי החיים ומעוררים חששות אתיים. מודלים של עור אנושי, ex vivo או מהונדסים רקמות, דורשים אישור אתי, עמידה בחקיקה מקומית ועולמית (חוק הרקמות האנושיות, הצהרת הלסינקי), ויש קושי ברכישת רקמות, כאשר חלק מהבקשות לוקחות שנים כדי למלא13,14. שני סוגי המודלים הם עתירי עבודה ודורשים מומחיות משמעותית כדי להבטיח הצלחה ניסיונית. חלק מהמודלים הנוכחיים של זיהום עור ex vivo דורשים דיסקים ותוספים מחוסנים מראש למיטת הפצע כדי לאפשר זיהום; למרות שמודלים אלה שימושיים להפליא, ישנן מגבלות בתהליך ההדבקה שכן תוספים מגבילים את השימוש במיטת הפצע כמקור תזונתי10,15,16,17. המודל המתואר במחקר זה אינו משתמש בתוספים למיטת הפצע, מה שמבטיח כי הפתולוגיה של זיהום וספירת תאים בת קיימא הם תוצאה של ניצול ישיר של מיטת הפצע כמקור ההזנה היחיד.
לאור הצורך בשיטות מעבדה חדשות, פותח מודל ex vivo ovine חדשני בעל תפוקה גבוהה של זיהומי עור לשימוש בהערכת היעילות של אנטיביוטיקה מתפתחת. מחקרים על דלקות עור מתמודדים עם אתגרים רבים - עלויות גבוהות, חששות אתיים ומודלים שאינם מראים תמונה מלאה20,21. מודלים של Ex vivo ומודלים תלת-ממדיים מאפשרים הדמיה טובה יותר של תהליך המחלה וההשפעה שיכולה להיות לטיפולים ממודל רלוונטי יותר מבחינה קלינית. כאן מתוארת ההגדרה של מודל עור שחלות חדשני, שהוא פשוט, ניתן לשחזור, ורלוונטי מבחינה קלינית ובעל תפוקה גבוהה. עור הביצית נבחר מכיוון שכבשים הן אחד היונקים הגדולים המשמשים בדרך כלל למודלים של תגובות לזיהומים in vivo. יתר על כן, הם זמינים בקלות מ abattoirs, הבטחת אספקה קבועה של העור למחקר, ואת הפגרים שלהם הם לא צרוב, מה שמבטיח איכות רקמות טובה. מחקר זה השתמש ב- S. aureus כפתוגן המופתי; עם זאת, המודל עובד היטב עם מיקרואורגניזמים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ראשיהם של כבשים מ-R.B אליוט וסון אבטויר שימשו כמקור לדגימות עור בפרויקט זה. כל הטלאים נשחטו לצריכה כמזון. במקום להשליך את הראשים, אלה שימשו מחדש למחקר. לא היה צורך באישור אתיקה מכיוון שהרקמה מקורה בפסולת שהושלכה מאבטוארים.
1. עיקור
- יש לחטא מלקחיים לפני איסוף הראשים על ידי לקיחת מלקחיים נקיים וביצוע עיקור בחום יבש בתנור בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך שעה. יש להשתמש בכל כלי הזכוכית בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות לפני השימוש.
- לבצע את כל העבודות המתוארות בתוך ארון מיקרוביולוגיה בכיתה 2. הכינו את כל הריאגנטים בהתאם להוראות היצרן.
2. איסוף דגימות
- באבטואר, כבשי סוואלדייל נטבחו על ידי מהמם באמצעות חשמל או אקדח בשבי והוצאו. לאסוף ראשי כבש לא יותר מ 4 שעות לאחר השחיטה.
3. הכנת הראשים
- יש לחטא את חלק המצח של הכבש על ידי שפיכת כ-100 מ"ל של תמיסת כלור דו-חמצני של 200 ppm על אזור הדגימה. לגלח את החלק המצח של הראש באמצעות קוצץ חשמלי לשטוף את האזור עם 200 מ"ל של 200 ppm כלור דו חמצני פתרון.
- נגבו את האזור באתנול ובגליל כחול וכסו את אזור הדגימה בקרם להסרת שיער למשך 35 דקות. יש לגרד בעדינות את הקרם להסרת שיער באמצעות כלי גירוד ולהעריך את אזור הדגימה. אם נותרה כמות משמעותית של שיער, חזור על תהליך הסרת השיער.
- השתמש עוד 200 מ"ל של תמיסת כלור דו חמצני כדי לשטוף את האזור, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול ולנגב עם גליל כחול.
- באמצעות אגרוף ביופסיה סטרילי בקוטר 8 מ"מ, יש לגזור דגימות עור בקוטר 8 מ"מ מהאזור המוכן. הסר את הדגימות באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל בעל 15 להבים, כדי להבטיח שכל השומן העורי יוסר.
- מניחים את הדגימות בצנצנת סטרילית של 0.5 ליטר מלאה בתמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS), ולאחר מכן מעבירים אותן לצינורות סטריליים של 50 מ"ל עם תמיסת 50 מ"ל של 200 ppm כלור דו-חמצני, הופכים פעמיים ומשאירים לעיקור למשך 30 דקות.
- הסר את הדגימות מתמיסת הכלור הדו-חמצני ושטוף אותן על ידי הצבתן בצינור של 50 מ"ל מלא ב-40 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר השטיפה, יש להניח כל דגימת עור בנפרד בבאר נפרדת של צלחת בת 24 בארות.
- הוסף 350 μL של מדיום מחומם מראש תוך שמירה על הדגימה בממשק אוויר-נוזל. הרכב המדיה הוא כדלקמן: מדיה MK (בינוני 199 עם מלחי הנקס, L-גלוטמט, ו-1.75 מ"ג/מ"ל נתרן ביקרבונט) ו-F12 של Ham ביחס של 1:1, עם תוספת FBS (10% v/v), EGF (10 ננוגרם/מ"ל), אינסולין (5 מיקרוגרם/מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL) ואמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל).
- אטמו את 24 לוחות הבאר עם אטם צלחת חדיר גז ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות של 5% CO2 למשך עד 24 שעות.
4. תחזוקת דגימות עור
- לאחר הדגירה, להסיר את מדיום התרבית ולשטוף את הדגימות ב 500 μL של PBS סטרילי. הוסיפו מדיה נטולת אנטיביוטיקה לכל דגימה ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות של 5% CO2 למשך 24 שעות כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה בדגימה.
- אם עכירות או זיהום פטרייתי מתפתחים במדיה נטולת אנטיביוטיקה לאחר 24 שעות, יש להשליך את הדגימה.
5. הכנת האינוקולום
- הכינו צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מרק סויה טריפטי סטרילי. קח צלחת אגר טרייה של S. aureus והשתמש במטוש כדי להעביר כמה מושבות לתוך המרק. דגירה במשך 18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-150 סל"ד.
- צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 3 דקות. הסר את supernatant ו להשעות את גלולת התא ב 10 מ"ל של PBS סטרילי. חזרו על הפעולה פעמיים כדי להבטיח שטיפה מספקת של התאים.
- התאם את האינוקולום ל- 0.6 OD600 ב- PBS סטרילי. אשר את עומס האינוקולום על ידי ביצוע ספירת צלחות ידנית בת קיימא.
6. זיהום של דגימות עור
- הכינו צלחת טרייה של 24 בארות עם 400 מיקרוליטר של מדיה נטולת אנטיביוטיקה שחוממה מראש והוסיפו את 24 הבארות באמצעות מלקחיים סטריליים.
- הסר את המדיה מדגימות העור, לשטוף עם 500 μL של PBS סטרילי, ולהסיר את הכביסה. השתמש מלקחיים סטריליים כדי להחזיק בעדינות את הדגימה בתחתית הבאר.
- השתמש בביופסיית אגרוף בקוטר 4 מ"מ כדי ליצור דש פצע מרכזי, החודר לעומק גס של 1-2 מ"מ. לאחר מכן, השתמש באזמל בעל 15 להבים ומלקחיים של רקמת allis שיניים סטריליות כדי להסיר את השכבה העליונה של דש הפצע. השתנות בממדי הפצע עשויה להשפיע על תוצאות הזיהום ועל היחידות היוצרות את מושבת הקצה (CFU).
- לאחר שכל הדגימות נפגעו, העבירו אותן לתוספות 24 הקידוחים באמצעות מלקחיים סטריליים. פיפטה 15 μL של האינוקולום החיידקי לתוך מיטת הפצע. לאחר מכן, דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות 5% CO2 .
- אם יש צורך בתקופות דגירה ארוכות יותר, מוציאים את המדיה ומחליפים אותה במדיה טרייה כל 24 שעות ודוגרים באותם תנאים.
7. קביעת העומס החיידקי
- הסר את המדיה מתחתית הבארות. עם מלקחיים סטריליים, להעביר כל דגימה לתוך צינור נפרד 50 מ"ל מלא 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- השתמש בהומוגנייזר בעל קצה דק כדי ליצור הומוגניזציה של פני השטח של הדגימה. היזהר כדי להבטיח כי המיטה הפצע הוא במגע ישיר עם קצה של homogenizer.
- הומוגני כל דגימה במשך 35 שניות על בינוני/גבוה. ההומוגנייזר מנתק את החיידקים מפני השטח של מיטת הפצע כדי לאפשר ספירה של עומס החיידקים.
- לאחר עיבוד כל הדגימות, מערבלים כל דגימה, בתורו, לפני הפיפטה. זאת כדי להבטיח שההומוגנט החיידקי מעורבב.
- פיפטה 20 μL של הומוגנט מערבולת לתוך הבאר המקבילה של צלחת 96 באר המכילה 180 μL של PBS סטרילי.
- יש לדלל באופן סדרתי כל דגימה הומוגנית ל-1 x 10−7 ופיפטה 10 μL של ההומוגנט המדולל על צלחת אגר סויה טריפטית במשולש.
- דגירה צלחת אגר במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ספור את מספר המושבות כדי לקבוע את CFU עבור כל דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי מסלול לעיקור העור לפני הגדרת מודל זיהום הפצע היה מאתגר. האתגר היה לעקר את העור מבלי לפגוע בשכבות העור השונות, מה שעלול לגרום להשלכות לא מכוונות על תוצאות הזיהום. כדי לזהות משטר עיקור מתאים, נוסו טיפולים שונים לפרקי זמן משתנים, כמפורט בטבלה 1. זיהום נרשם כהתפתחות עכירות לאחר 48 שעות במדיום MK המשמש לשמירה על דגימות העור. שלמות הרקמות נותרה על ידי היסטולוגיה ולאחר מכן הכתמה עם המטוקסילין ואוזין (H&E) מיד לאחר הטיפול (איור 1). טיפול של 30 דקות בכלור דו-חמצני הוכח כיעיל ביותר בעיקור מחדש של רקמת העור תוך שמירה על שלמות הרקמה.
במערך הניסוי, הרקמה הסטרילית הפצועה ממוקמת בחדר האפיקלי של תוסף 24 בארות בממשק האוויר-נוזל (איור 2A). נעשו שתי טכניקות פציעה שונות - טכניקה להסרת דש, שבה הרקמה נפגעת על ידי כלי ביופסיית אגרוף והשכבה העליונה של הרקמה הפצועה מוסרת באמצעות שילוב של אזמל 15 להבים ומלקחיים סטריליים של רקמת אליס, וטכניקת שריטה, שבה הרקמה נפגעת על ידי כלי ביופסיית אגרוף בלבד. למרות שמודל השריטה הכיל מספר ממוצע גבוה יותר של יחידות יוצרות מושבה לאחר 24 שעות, התוצאות היו משתנות. טכניקת הסרת הדש הניבה תוצאות עקביות יותר (איור 2C). לאחר 48 שעות, בערך פי 100 יותר יחידות CFU חיידקיות התאוששו מהרקמה הפצועה בהשוואה לאינוקולום (איור 2D). זה נחשב כמצביע על זיהום מוצלח. סרט לבן במיטת הפצע נראה על הרקמה 48 שעות לאחר ההדבקה (איור 2B). מקטעים היסטולוגיים מוכתמים בגרם של רקמה נגועה הצביעו על הימצאותם של תאי S. aureus במיטת הפצע (איור 2E,F). מקטעים היסטולוגיים מוכתמים בגרם של רקמות לא נגועות מסופקים כמשווה (איור 2G,H).
מראש כבש אחד, ניתן לגשת באופן מציאותי למקטע 100 ס"מ 2 (10 ס"מ על10 ס"מ). בהתחשב בכך שכל פיסת עור מנוקבת מהמצח באמצעות ביופסיית אגרוף עגולה בקוטר 8 מ"מ, ניתן לקבל כ-100 כתמי עור ממצחו של כבש אחד בשבוע. רכישת ראשי כבשים נוספים מגדילה באופן יחסי את מספר דגימות העור שניתן לקבל בשבוע. לפיכך, נטען כי ההליך הוא בעל תפוקה גבוהה יחסית. עבור מחקר זה, 24 דגימות עור התקבלו באופן שגרתי בשבוע. עור מראשי כבשים שונים עובד כשכפלים ביולוגיים כדי להסביר את השתנות התורם הפוטנציאלי לתורם. במהלך הכנת מדבקות העור (שלבים 3.1-3.8), צריכת הזמן העיקרית היא דגירה של 30 דקות של דגימות העור בתמיסת הכלור הדו-חמצני וההמתנה של 2 x 35 דקות לטיפול קרם להסרת שיער. השימוש בביופסיית אגרוף ליצירת 24 מדבקות העור אורך כ-15 דקות. הפעם זה היה מתרחב באופן ליניארי אם מספר כתמי העור היה גדל.
| חומר חיטוי | 10 דק' | 30 דק' | 60 דק' |
| 1% חומר לחיטוי משטחים רפואיים ברמה גבוהה | F | P | P |
| 1% חומר חיטוי רב תכליתי | F | F | P |
| 3% פובידון | F | F | F |
| 5% פובידון | F | P | P |
| 10% פובידון | F | P | P |
| 70% אתנול | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0.55% היפוכלוריט | F | P | P |
| 200 ppm כלור דו-חמצני | F | P | P |
טבלה 1: עיקור עור טלה טרי. כל דגימת עור הושארה בחומר החיטוי למשך הזמן שצוין. F מציין כישלון לעקר את הרקמה, עם זיהום חיידקי נוכח בתקשורת. P מציין מעבר, ללא זיהום חיידקי נוכח בתקשורת.
איור 1: היסטולוגיה של עור ex vivo ovine לא נגוע שטופל בחומרי חיטוי (כתם H&E) בהגדלה של פי 100. (A) שליטה בדגימת עור עם טיפול של 30 דקות ב- PBS. ניתן לראות נשירת אפידרמיס מסוימת, אך האפידרמיס אינו מופרע. (B) עור בקר שטופל ב-1% חומר חיטוי משטחים רפואי ברמה גבוהה במשך 30 דקות. נשירת האפידרמיס (חץ שחור) יחד עם הפרעה מסוימת לשכבת הגרנולוזום (חץ כחול). (C) עור הבקר שטופל ב-5% פובידון במשך 30 דקות. ניתן לראות כאן פגיעה מתונה ברקמה, עם נשירת האפידרמיס של שכבת הקרנית (חץ שחור). יש הפרעה מינימלית לשכבות האפידרמיס שמתחת. (D) עור הביצית שטופל ב-10% פובידון במשך 30 דקות. השכבות העליונות של האפידרמיס נפגעו, עם עדות לנשירה (חץ שחור) והידלדלות (חץ ירוק). (E) עור ביצית שטופל ב-2% חומר חיטוי רב-תכליתי במשך 30 דקות. ניתן להבחין בנזק חמור לדגימה, עם שפיכת אפידרמיס משמעותית (חץ שחור) והשמדה מוחלטת של שכבת הקרנית (חץ אדום). (F) עור בקר שטופל בכלור דו-חמצני של 200 ppm במשך 30 דקות. ניתן לראות נשירת אפידרמיס מסוימת, אך האפידרמיס שלם. (G) עור בקר שטופל ב-0.6% היפוכלוריט במשך 30 דקות. קיים נזק חמור לאפידרמיס, עם רמה גבוהה של נשירת אפידרמיס (חץ שחור) ומיגור האפידרמיס במקומות (חץ אדום). (H) עור בקר שטופל ב-70% אתנול במשך 30 דקות. ניתן לראות נזק לאפידרמיס, עם נשירת אפידרמיס משמעותית (חץ שחור). סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: עור אקס-ויוו אובין נגוע ב-S. aureus. (A) סכמטי של מערך הניסוי. (B) תמונות של עור ביצית ex vivo לפני ההדבקה (תמונה שמאלית) ופוסט 48 שעות זיהום (תמונה ימנית). שימו לב לסרט הלבן הקיים לאחר דגירה של 48 שעות ברקמה נגועה, אשר נעדרת ברקמה לא נגועה. (C) בדיקת ההשפעה של שיטות פציעה שונות על יחידת יצירת המושבה הסופית (CFU) לאחר הומוגניזציה. הסרת דש (n = 6) ושריטה (n = 9) נגוע S. aureus במשך 24 שעות. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. מציין ערך p < 0.0001. (D) בדיקת ההשפעה של זמני הדגירה על ספירות CFU לאחר הומוגניזציה. דגירה של 24 שעות (n = 6) ודגירה של 48 שעות (n = 12). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. מציין ערך p < 0.0001. (ה,ו) תמונות מייצגות של ניתוח היסטופתולוגי של עור ביצית נגוע לאחר זיהום של 48 שעות עם כתם גרם שונה (E) בהגדלה של 100x (סרגל קנה מידה של 200 מיקרומטר). התיבה מציינת את השטח המוגדל ב- (F) בהגדלה של 1,000x (סרגל קנה מידה של 50 מיקרומטר). חיצים שחורים מצביעים על חיידקים. (ז,ח) תמונות מייצגות של ניתוח היסטופתולוגי של עור ביצית לא נגוע לאחר פרק זמן של 48 שעות (שליטה) עם כתם gGram שונה (G) בהגדלה של 100x (סרגל קנה מידה של 200 מיקרומטר). התיבה מציינת את השטח המוגדל ב- (H) בהגדלה של 1,000x (פס קנה מידה של 50 מיקרומטר). הניתוח הסטטיסטי בוצע כ- ANOVA חד כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתוח מיקרוביאלים הוא מיזם חשוב אך יקר, שעלותו מוערכת בכמיליארד דולר ונמשכת כ-15 שנה. מעל 90% מגילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות ומחקרים פרה-קליניים של יעילות תרופות אנטי-מיקרוביאליות מתבצעים על ידי חוקרים אקדמיים וחברות קטנות עד בינוניות עם בדרך כלל פחות מ-50 עובדים22. צוותים אלה מוגבלים מאוד מבחינה כלכלית, מה שהופך את הכישלון של מולקולות עופרת בשלבים מאוחרים יותר של מחקר תרגומי לאסון. העלייה בעמידות האנטי-מיקרוביאלית עולה על התפתחותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים, מה שמעצים עוד יותר את הצורך לנהל את ההשקעה המוגבלת ממילא במחקר אנטי-מיקרוביאלי באופן אחראי23.
הפער בפיזיולוגיה החיידקית בין זיהומים in vivo ותרביות מעבדה במבחנה נוטה לגרום להערכת יתר של היעילות האנטי-מיקרוביאלית של הפגיעות בשלב זיהוי העופרת. הערכת יתר כזו תורמת לשיעורי ההתשה הגבוהים שנראו בשלבים הבאים של התרגום. הזמינות של פלטפורמות בדיקת יעילות אנטי-מיקרוביאלית במבחנה, המשלבות חיידקים עם פיזיולוגיה המחקה טוב יותר את אלה שנמצאו במהלך זיהומים in vivo, תאפשר הערכה מדויקת יותר של יעילות מיקרוביאלית ותספק לחוקרים שליטה רבה יותר על אופטימיזציה של עופרת ללא הסתמכות על ניסויים יקרים ומווסתים היטב בבעלי חיים. מודלים כאלה גם יפחיתו את שיעורי ההתשה בשלבים הבאים של התרגום ועשויים להפוך את גילוי התרופות האנטי-מיקרוביאליות לאטרקטיבי יותר להשקעה.
מודל זה של זיהום בעור השחלות המתואר כאן הוא כלי שימושי שיספק לחוקרים מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של פצע נגוע כדי לבחון את היעילות של פורמולציות אנטי-מיקרוביאליות מקומיות מתפתחות בשלבים הפרה-קליניים. בניגוד לרוב המודלים של זיהום ex vivo המתוארים בספרות המדעית 10,15,24,25,26,27,28, במודל זה, הפתוגנים שנחשפו לרקמת ex vivo אינם מתווספים לתרבית מדיה במהלך ההדבקה. התפשטות פתוגנים וזיהום לאחר מכן תלויים ביכולתו של האורגניזם לפגוע ברקמה. לכן, הפיזיולוגיה הפתוגנית במודל זה קשורה קשר הדוק יותר לזה במהלך זיהומים in vivo בהשוואה לתרביות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות. זיהום הניתן לשחזור מתקבל ממודל זה, כפי שנשפט על ידי מספר יחידות ה- CFU שנשלפו מהרקמה לאחר הדגירה.
עם שפע של מקבילות עור אנושיות ומודלים אנושיים וחזיריים של פצעי ex vivo, ניתן לטעון באופן שטחי שהשימוש ברקמת שחלות במודל זה כמגבלה. עם זאת, כבשים נמנות עם קבוצת בעלי החיים הגדולים המשמשים כמודלים של זיהומים in vivo 29,30,31. יתר על כן, כבשים שימשו כפונדקאיות לבני אדם במחקר אימונולוגיה ופיתוח חיסונים, מה שמצביע על כך שהתגובות החיסוניות שלהן דומות לאלה של בני אדם32. תהליך תיקון הרקמות במהלך ריפוי פצעים דומה ביונקים גדולים, כולל כבשים ובני אדם33,34, והתערבויות לשיפור ריפוי פצעים שהוכחו בהצלחה בכבשים הוצעו לתרגום לבני אדם35,36,37. לכן, השימוש בעור ex vivo ovine במודל פצע זה אינו מגבלה. יתר על כן, ניתן לשפוט מודל אובין זה כחלופה אמינה למודלים המשלבים עור אנושי או חזיר מהסיבות הבאות. הזמינות של עור האדם מוגבלת ובאיכות משתנה כאשר היא זמינה38. אפידרמיס אנושי מהונדס רקמות ומקבילות עור חי דורשים עידונים בתנאי התרבות שלהם כדי להבטיח שכפול בפיזיולוגיה של הרקמה39. למרות שעור חזירי נגיש יותר מעור האדם, העור החזירי הזמין באופן נרחב נצרב כחלק מעיבוד פגרים באבטואר, אשר מסיר את האפידרמיס10. מניסיון, עור חזירי לא מצופה הוא פחות זמין מ abattoirs.
לאורך כל הפרוטוקול המתואר כאן, ישנם צעדים קריטיים המבטיחים את הצלחת המודל. השלב הקריטי ביותר כרוך בעיקור הרקמה לאחר הקציר. יש לערבב תמיסת כלור דו-חמצני עם דגימות הרקמה, ולאפשר זמן מגע של 30 דקות כדי לחטא את הרקמה ולהסיר מזהמים. יתר על כן, בעת עריכת ניסוי זה, עכירות או זיהום פטרייתי עלולים להתרחש עקב טיפול לא נכון או טיפול לא יעיל בחומרי חיטוי ובמדיה אנטיביוטית. במקרה כזה, יש להשליך דגימות המפתחות עכירות. כדי להפחית את התפתחות העכירות והזיהום, יש לשמור על סביבת המעבדה נקייה, עם עיקור תכוף של האינקובטור, שימוש בקצוות מסנן, והבטחת עיקור מלא של הכלים והמיכלים המשמשים עם הדגימות. שלב קריטי נוסף בפרוטוקול הוא כאשר אגרוף ביופסיה 4 מ"מ משמש לפצע את הרקמה. השימוש בכלי זה מאפשר מיטות פצע בגודל דומה כדי להבטיח את חזרתיות ושכפול הפרוטוקול. שונות בגודל מיטת הפצע משפיעה על CFU של נקודת הקצה. כאשר יש הסרה נאותה של דש הרקמה, התוצאות הן הרבה יותר עקביות. שלב קריטי נוסף הקשור לשלמות ספירת CFU של נקודות הקצה הוא השימוש בהומוגנייזר בעל הקצה העדין לשחרור תאי חיידקים. המיקום של קצה ההומוגנייזר נראה כבעל השפעה על ספירת CFU מדגימה לדגימה; כאשר הקצה הונח כראוי ישירות על מיטת הפצע, נראתה הרבה פחות שונות מדגימה לדגימה.
עם זאת, המודל המוצע כאן אינו נטול מגבלות. למודל זה יש מגבלות הטבועות בכל מחקרי ex vivo (כלומר, היעדר זרימה וסקולרית פעילה, היעדר מיקרוביוטה קומנסלית, שעשויה לווסת את התקדמות הזיהום, והיעדר תאי חיסון). ניתן לטעון כי מאחר שמודל הפצע ex vivo אינו משלב תאים פעילים של מערכת החיסון, התקדמות הזיהום in vivo בנוכחות תאים אלה עשויה להיות שונה מזו שנצפתה במודלים של ex vivo . ללא קשר, מודלים של ex vivo מספקים משטח רקמה לחיבור ומקור הזנה לחיידקים ומציגים מחסום דיפוזיה תלת-ממדי לפורמולציות, המאפשר הערכה מדויקת יותר של יעילות מיקרוביאלית מאשר טכניקות תרבית מיקרוביולוגיות קונבנציונליות.
יתרון מרכזי של המודל הוא שהרקמה מקורה בכבשים המגודלים למאכל אדם. באופן ספציפי יותר, הדגם משנה את ייעודה של עור מראשי הכבשים, שבדרך כלל מושלכים. יתר על כן, למודל יש תפוקה גבוהה והוא מאפשר מחקרים השוואתיים חסכוניים, מהירים וניתנים לשחזור. ניתן לטעון כי זמינותו של מודל זה תפחית ותשכלל את הצורך בגידול בעלי חיים לצורך מחקר תרגומי בהתאם לעקרונות שלושת ה-Rs, המאפשרים פרקטיקות מחקר הומאניות יותר. למרות שהמודל המתואר כאן משלב את S. aureus כפתוגן המופתי, ניתן להשתמש במודל עם מיקרואורגניזמים אחרים כולל חיידקים, פטריות ווירוסים אחרים, ובכך להרחיב את היקף פיתוח התרופות שהמודל מאפשר. ניתן לחזות כי השימוש במודל זה יאפשר תרגום מהיר של אנטיביוטיקה נחוצה לזיהומי עור על ידי מתן שליטה רבה יותר לחוקרים על תכנון וניסוח תרופות בשלבים הפרה-קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות ל-EPSRC (EP/R513313/1) על המימון. המחברים רוצים להודות גם לר.ב. אליוט וסון אבטויר בקאלואו, צ'סטרפילד, על כך שסיפקו את ראשיהם של הטלאים ועל כך שהיו כל כך נעימים בשלבים המוקדמים של הפרויקט, לקסיה אמרי על תמיכתה לאורך כל פיתוח הפרוטוקול הזה, ולפיונה רייט מהמחלקה לזיהום, חסינות ומחלות לב וכלי דם באוניברסיטת שפילד על עיבוד דגימות ההיסטולוגיה ועל היותם כל כך מועילים להפליא לאורך כל הפרויקט הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
