Summary
이 프로토콜은 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델을 설정하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 고처리량 모델은 기존 미생물학 기술에 비해 생체 내 감염을 더 잘 시뮬레이션하고 연구자에게 새로운 항균제의 효능을 테스트할 수 있는 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
항균제의 개발은 성공률이 점점 낮아지는 값비싼 과정이므로 항균 발견 연구에 대한 추가 투자가 덜 매력적입니다. 항균 약물 발견 및 후속 상용화는 연구자가 약물 설계 및 제형을 더 잘 제어할 수 있는 리드 최적화 단계 내에서 페일패스트 앤 페일-싸게 접근 방식을 구현할 수 있다면 더 수익성이 높아질 수 있습니다. 이 기사에서는 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델의 설정에 대해 설명하며, 이는 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높고 재현 가능합니다. 모델의 박테리아 생리학은 박테리아 증식이 조직을 손상시키는 병원체의 능력에 의존하기 때문에 감염 동안 모방합니다. 상처 감염의 확립은 접종 원에 비해 생존 가능한 박테리아 수의 증가에 의해 확인됩니다. 이 모델은 리드 최적화 단계에서 새로운 항균제의 효능을 테스트하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 이 모델의 가용성은 항균제를 개발하는 연구자들에게 실패-빠른-실패-값싼 모델을 제공하여 후속 동물 실험에서 성공률을 높이는 데 도움이 될 것이라고 주장할 수 있습니다. 이 모델은 또한 연구를 위한 동물 사용의 감소 및 개선을 촉진하고 궁극적으로 피부 및 연조직 감염에 대한 새로운 항균제를 클리닉으로 더 빠르고 비용 효율적으로 번역할 수 있도록 합니다.
Introduction
피부 감염은 전 세계적으로 중요한 문제이며 전 세계 의료 서비스 제공자에게 막대한 경제적 비용이 발생합니다. 병원균에 의한 다제 내성 및 생물막 형성의 발달은 치유되지 않는 상처 1,2,3,4의 유병률에 중요한 역할을합니다. 그 결과, 피부 및 연조직 감염은 장기 입원 및 후속재입원의 가장 일반적인 이유 중 하나입니다5. 상처 치유의 지연은 환자와 의료 제공자 모두에게 비용이 많이 들며, 일부 추정치는 미국에서 매년 약 650 만 명의 환자가 영향을 받는다고 제안합니다. 영국에서는 피부 감염 및 관련 합병증으로 인해 매년 약 75,000 명이 사망합니다 2,4,6.
황색포도상구균(S. aureus)은 환자의 상처 2,7에서 자주 분리되는 강력한 상처 병원체입니다. 다제 내성의 출현률은 2000 년대에 급격히 증가했습니다. 이 기간 동안 급성 세균성 피부 및 피부 구조 감염의 약 60%가 메티실린 내성 S. 아우레우스1에 대해 배양 양성이었습니다. 지난 2 년 동안 포도상 구균 및 실제로 다른 병원균 중 다제 내성 균주의 수가 증가함에 따라 내성을 극복 할 수있는 새로운 작용 방식을 가진 항생제의 신속한 개발이 시급히 필요함을 나타냅니다.
그러나 2000년대 초반부터 항생제 발견 프로그램은 개발 시간이 길어지고 성공률이 낮아져 미국에서 임상 시험에 진입한 새로운 항생제의 17%만이시장 승인을 획득했습니다8. 이는 신종 항생제의 시험관 내 테스트 결과와 임상 결과 간의 차이를 시사합니다. 이러한 불균형은 주로 생체 내 감염 중 및 시험관 내 전임상 단계에서 항생제의 효능을 테스트 할 때 기존의 미생물 학적 방법 동안 박테리아 생리학의 차이 때문이라고 주장 할 수 있습니다. 따라서 항생제 발견 프로그램의 성공률을 높이기 위해 감염 중 박테리아 생리학을보다 잘 대표하는 새로운 실험실 방법이 필요합니다.
피부 감염을 연구하기 위한 현재의 방법은 살아있는 동물(예를 들어, 마우스), 생체외 피부 모델(예를 들어, 돼지), 및 3D 조직-조작된 피부 모델(예를 들어, 인간)에 대한 연구를 포함한다9,10,11,12. 살아있는 동물에 대한 연구는 엄격하게 규제되며 처리량이 상대적으로 낮습니다. 동물 모델에서 상처와 감염은 동물에게 심각한 고통을 유발하고 윤리적 문제를 제기합니다. 생체 외 또는 조직 공학적 인간 피부 모델은 윤리적 승인, 지역 및 글로벌 법률 (인체 조직법, 헬싱키 선언) 준수가 필요하며 조직 획득에 어려움이 있으며 일부 요청은13,14를 이행하는 데 수년이 걸립니다. 두 모델 유형 모두 노동 집약적이며 실험적 성공을 보장하기 위해 상당한 전문 지식이 필요합니다. 일부 현재의 생체 외 피부 감염 모델은 감염을 가능하게 하기 위해 상처 베드에 사전 접종된 디스크와 첨가제가 필요합니다. 이러한 모델은 매우 유용하지만 첨가제가 영양 공급원으로서 상처 침대의 활용을 제한하기 때문에 감염 과정에 한계가 있습니다10,15,16,17. 이 연구에서 설명된 모델은 상처 베드에 첨가제를 사용하지 않으므로 감염 병리 및 생존 가능한 세포 수가 상처 베드를 유일한 영양 공급원으로 직접 활용한 결과입니다.
새로운 실험실 방법의 필요성을 감안할 때, 새로운 항생제의 효능을 평가하는 데 사용하기 위한 피부 감염의 새로운 고처리량 생체 외 난소 모델이 개발되었습니다. 피부 감염 연구는 높은 비용, 윤리적 문제 및 전체 그림을 보여주지 않는 모델20,21과 같은 많은 문제에 직면해 있습니다. 생체 외 모델과 3D 체외이식편 모델을 사용하면 질병 과정을 더 잘 시각화할 수 있으며 치료가 임상적으로 더 관련성이 높은 모델에서 미칠 수 있는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에서, 신규한 양 피부 모델의 설정이 설명되며, 이는 간단하고 재현 가능하며 임상적으로 관련이 있고 높은 처리량을 갖는다. 난소 피부는 생체내에서 감염에 대한 반응을 모델링하기 위해 일반적으로 사용되는 대형 포유동물 중 하나인 양으로 선택되었다. 또한 도축장에서 쉽게 구할 수 있어 연구를 위한 피부를 안정적으로 공급할 수 있으며 시체에 화상이 없어 좋은 조직 품질을 보장합니다. 이 연구는 S. 아우 레 우스를 모범 병원체로 사용했습니다. 그러나이 모델은 다른 미생물과 잘 작동합니다.
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Protocol
R.B Elliott와 Son Abattoir의 어린 양 머리는 이 프로젝트에서 피부 샘플의 소스로 사용되었습니다. 모든 어린 양은 음식으로 소비하기 위해 도살되었습니다. 머리를 버리는 대신 연구를 위해 용도가 변경되었습니다. 조직이 도축장에서 버려진 폐기물에서 공급되었기 때문에 윤리 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 살균
- 머리를 모으기 전에 깨끗한 집게를 취하고 200 ° C의 오븐에서 1 시간 동안 건열 살균을 수행하여 집게를 소독하십시오. 사용하기 전에 모든 유리 제품을 121 ° C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.
- 미생물학 클래스 2 캐비닛 내에서 설명 된 모든 작업을 수행하십시오. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.
2. 샘플 수집
- 도살장에서 Swaledale 양들은 전기나 포로 볼트 권총을 사용하여 기절시켜 도살하고 멸종되었습니다. 도축 후 4 시간 이내에 양고기 머리를 수집하십시오.
3. 머리 준비
- 시료 부위에 약 100mL의 이산화염소 용액 200mL를 부어 양고기의 이마 부분을 소독합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 머리의 이마 부분을 면도하고 200ppm 이산화 염소 용액 200mL로 해당 부위를 씻습니다.
- 에탄올과 블루 롤로 해당 부위를 닦고 샘플 부위를 제모 크림으로 35분 동안 덮습니다. 긁는 도구를 사용하여 제모 크림을 부드럽게 긁어내고 샘플 영역을 평가합니다. 상당한 양의 머리카락이 남아 있으면 제모 과정을 반복하십시오.
- 이산화염소 용액 200mL를 추가로 사용하여 해당 부위를 헹군 다음 에탄올로 헹구고 파란색 롤로 닦습니다.
- 멸균 된 8mm 생검 펀치를 사용하여 준비된 영역에서 8mm 피부 샘플을 잘라냅니다. 멸균 집게와 15 날 메스를 사용하여 샘플을 제거하여 모든 피부 지방이 제거되도록합니다.
- 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 멸균 0.5L 병에 샘플을 넣은 다음 200ppm 이산화염소 용액 50mL가 포함된 멸균 50mL 튜브로 옮기고 두 번 뒤집은 다음 30분 동안 멸균되도록 둡니다.
- 이산화염소 용액에서 샘플을 제거하고 40mL의 멸균 PBS로 채워진 50mL 튜브에 넣어 세척합니다. 세척이 완료되면 각 개별 피부 샘플을 24웰 플레이트의 별도의 웰에 놓습니다.
- 공기-액체 계면에서 샘플을 유지하면서 예열된 배지 350μL를 추가합니다. 배지의 조성은 다음과 같습니다 : MK 배지 (행크스 염, L- 글루타메이트 및 1.75 mg / mL 중탄산 나트륨이 포함 된 배지 199) 및 햄의 F12는 FBS (10 % v / v), EGF (10 ng / mL), 인슐린 (5 μg / mL), 페니실린-스트렙토 마이신 (100 U / mL) 및 암포 테리 신 B (2.5 μg / mL)가 첨가 된 1 : 1 비율입니다.
- 24웰 플레이트를 가스 투과성 플레이트 씰로 밀봉하고 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 최대 24시간 동안 37°C에서 배양합니다.
4. 피부 샘플의 유지 관리
- 배양 후, 배양 배지를 제거하고, 샘플을 500 μL의 멸균 PBS로 헹구었다. 각 샘플에 무항생제 배지를 추가하고 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양하여 샘플의 잔류 항생제를 제거합니다.
- 24 시간 후에 항생제가없는 배지에서 탁도 또는 곰팡이 감염이 발생하면 샘플을 폐기하십시오.
5. 접종물의 제조
- 멸균 트립신 콩 브로스 10mL가 포함된 50mL 튜브를 준비합니다. S. aureus 의 신선한 한천 접시를 가지고 면봉을 사용하여 여러 식민지를 국물에 옮깁니다. 150 rpm에서 37°C에서 18시간 동안 배양한다.
- 4,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 멸균 PBS 10mL에 재현탁시킨다. 세포를 적절하게 세척하기 위해 두 번 반복하십시오.
- 접종물을 멸균 PBS에서 0.6OD600 으로 조정한다. 수동 실행 가능한 플레이트 수를 수행하여 접종 부하를 확인합니다.
6. 피부 샘플의 감염
- 400μL의 사전 예열된 무항생제 배지로 새로운 24웰 플레이트를 준비하고 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트를 추가합니다.
- 피부 샘플로부터 배지를 제거하고, 500 μL의 멸균 PBS로 세척하고, 세척물을 제거한다. 멸균 집게를 사용하여 샘플을 우물 바닥에 부드럽게 고정하십시오.
- 4mm 펀치 생검을 사용하여 중앙 상처 플랩을 만들고 1-2mm의 거친 깊이까지 관통합니다. 그런 다음 15날 메스와 멸균 톱니 앨리스 조직 집게를 사용하여 상처 플랩의 최상층을 제거합니다. 상처 치수의 가변성은 감염 및 종점 콜로니 형성 단위(CFU)의 결과에 영향을 미칠 수 있다.
- 모든 샘플이 감겨지면 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트로 옮깁니다. 15 μL의 박테리아 접종물을 상처 베드에 피펫팅합니다. 이어서, 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 더 긴 잠복기가 필요한 경우 배지를 제거하고 24시간마다 새 배지로 교체하고 동일한 조건에서 배양합니다.
7. 박테리아 부하의 결정
- 우물 바닥에서 미디어를 제거하십시오. 멸균 집게를 사용하여 각 샘플을 멸균 PBS 1mL로 채워진 별도의 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 미세한 팁 균질화를 사용하여 샘플 표면을 균질화하십시오. 상처 베드가 균질화기의 팁과 직접 접촉하도록주의하십시오.
- 중간/높음에서 35초 동안 각 샘플을 균질화합니다. 균질화기는 박테리아 부하의 열거를 허용하기 위해 상처 베드의 표면에서 박테리아를 분리합니다.
- 모든 샘플이 처리되면 피펫팅 전에 각 샘플을 차례로 와동시킵니다. 이것은 박테리아 균질액이 혼합되도록 하기 위한 것입니다.
- 20 μL의 볼텍싱된 균질액을 180 μL의 멸균 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트의 상응하는 웰 내로 피펫팅한다.
- 각 샘플 균질액을 1 x 10-7 로 연속 희석하고 희석된 균질액 10 μL를 트립신 대두 한천 플레이트에 3배로 피펫팅합니다.
- 한천 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 콜로니 수를 계산하여 각 샘플에 대한 CFU를 결정합니다.
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Representative Results
상처 감염 모델을 설정하기 전에 피부를 살균하는 경로를 식별하는 것은 어려웠습니다. 문제는 다른 피부층을 손상시키지 않고 피부를 살균하는 데 있었으며, 이는 감염의 결과에 의도하지 않은 결과를 초래할 수 있습니다. 적절한 멸균 요법을 확인하기 위해, 표 1에 요약된 바와 같이, 다양한 기간 동안 상이한 처리가 시도되었다. 오염은 피부 샘플을 유지하기 위해 사용된 MK 배지에서 48시간 후의 탁도의 발달로서 기록되었다. 조직 무결성은 조직학에 의해 모니터링되었고, 치료 직후 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색되었습니다 (그림 1). 이산화염소로 30분 동안 처리하면 조직 무결성을 유지하면서 피부 조직을 재현 가능하게 살균하는 데 가장 효과적인 것으로 입증되었습니다.
실험 설정에서 상처 입은 멸균 조직은 공기-액체 계면에 있는 24웰 삽입물의 정점 챔버에 배치됩니다(그림 2A). 펀치 생검 도구로 조직을 감고 15 날 메스와 멸균 톱니 앨리스 조직 집게의 조합을 사용하여 상처 조직의 최상층을 제거하는 플랩 제거 기술과 펀치 생검 도구 만으로 조직을 감는 스크래치 기술. 스크래치 모델은 24시간 후에 더 높은 평균 CFU 수를 보유했지만 결과는 가변적이었습니다. 플랩 제거 기술은 보다 일관된 결과를 생성했습니다(그림 2C). 48시간 후, 접종물에 비해 상처 조직에서 약 100배 더 많은 박테리아 CFU가 회수되었습니다(그림 2D). 이것은 성공적인 감염을 나타내는 것으로 간주되었습니다. 상처 베드의 흰색 필름은 감염 후 48 시간 후에 조직에서 분명했습니다 (그림 2B). 감염된 조직의 그람 염색 조직학 섹션은 상처 층에 S. aureus 세포의 존재를 나타냅니다 (그림 2E, F). 감염되지 않은 조직의 그람 염색 조직학 섹션이 비교기로 제공됩니다(그림 2G, H).
한 마리의 어린 양의 머리에서 100cm2 섹션 (10cm x 10cm)을 사실적으로 접근 할 수 있습니다. 직경 8mm의 원형 펀치 생검을 사용하여 이마에서 각 피부 패치를 펀칭하면 일주일에 한 마리의 어린 양의 이마에서 약 100개의 피부 패치를 얻을 수 있습니다. 어린 양의 머리를 더 조달하면 일주일에 얻을 수있는 피부 샘플의 수가 비례하여 증가합니다. 따라서 절차가 상대적으로 높은 처리량이라고 주장됩니다. 이 연구를 위해 일주일에 24 개의 피부 샘플을 정기적으로 얻었습니다. 다양한 양의 머리로부터의 피부는 잠재적 인 기증자 대 기증자 가변성을 설명하기 위해 생물학적 복제물로 처리되었다. 피부 패치를 준비하는 동안(단계 3.1-3.8), 주요 시간 소모는 이산화염소 용액에서 피부 샘플을 30분 인큐베이션하고 제모 크림 처리를 위해 2 x 35분 대기하는 것이다. 펀치 생검을 사용하여 24 개의 피부 패치를 생성하는 데 약 15 분이 걸립니다. 이번에는 피부 패치의 수가 증가하면 선형적으로 확장됩니다.
| 살균제 | 10 분 | 30 분 | 60 분 |
| 1% 고급 의료용 표면 소독제 | F | P | P |
| 1% 다목적 소독제 | F | F | P |
| 3% 포비돈 | F | F | F |
| 5 % 포비돈 | F | P | P |
| 10% 포비돈 | F | P | P |
| 70 % 에탄올 | F | P | P |
| 자외선 | F | F | F |
| 0.55% 차아염소산염 | F | P | P |
| 200ppm 이산화염소 | F | P | P |
표 1 : 신선한 양고기 피부의 살균. 각 피부 샘플을 지정된 시간 동안 소독제에 방치하였다. F는 매체에 박테리아 오염이 존재하는 조직을 멸균하지 못했음을 나타냅니다. P는 매체에 박테리아 오염이 없는 통과를 나타냅니다.
그림 1 : 100x 배율에서 소독제 (H & E 염색)로 처리 된 감염되지 않은 생체 내 피부의 조직학. (A) PBS에서 30 분 처리로 피부 샘플을 대조하십시오. 일부 표피 흘림을 볼 수 있지만 표피는 손상되지 않습니다. (B) 30 분 동안 1 % 고급 의료용 표면 소독제로 처리 된 난소 피부. 표피 흘림 (검은 색 화살표)과 함께 과립 지층 (파란색 화살표)에 약간의 혼란이 있습니다. (C) 30분 동안 5% 포비돈으로 처리된 난소 피부. 조직에 대한 중등도의 손상은 각질층의 표피 흘림 (검은 색 화살표)과 함께 여기에서 볼 수 있습니다. 밑에있는 표피층에 최소한의 파괴가 있습니다. (D) 30 분 동안 10 % 포비돈으로 처리 된 난소 피부. 표피의 최상층이 손상되어 흘리기 (검은 색 화살표)와 얇아 짐 (녹색 화살표)의 증거가 있습니다. (E) 2 % 다목적 소독제로 30 분 동안 처리 된 난소 피부. 샘플에 대한 심각한 손상이 관찰 될 수 있으며, 상당한 표피 흘림 (검은 색 화살표)과 각질층의 완전한 박멸 (빨간색 화살표)이 관찰 될 수 있습니다. (F) 200ppm 이산화염소에서 30분 동안 처리된 난소 피부. 일부 표피 흘림을 볼 수 있지만 표피는 손상되지 않습니다. (G) 0.6% 차아염소산염으로 30분 동안 처리된 난소 피부. 표피에 심각한 손상이 있으며, 높은 수준의 표피 흘림 (검은 색 화살표)과 장소에서 표피의 박멸 (빨간색 화살표)이 있습니다. (H) 30 분 동안 70 % 에탄올로 처리 된 난소 피부. 표피 손상은 상당한 표피 흘림 (검은 색 화살표)과 함께 볼 수 있습니다. 스케일 바는 200 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: S. 아우레우스에 감염된 생체 외 난소 피부. (A) 실험 설정의 개략도. (B) 감염 전 생체 외 난소 피부 사진 (왼쪽 이미지) 및 감염 후 48 시간 (오른쪽 이미지). 감염된 조직에서 48 시간 배양 후 나타나는 흰색 필름에 주목하십시오.이 필름은 감염되지 않은 조직에는없는 것입니다. (C) 균질화 후 최종 콜로니 형성 단위(CFU) 수에 대한 다양한 상처 방법의 효과 테스트. 플랩 제거 (n = 6) 및 스크래치 (n = 9)는 24 시간 동안 S. aureus에 감염되었습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 는 p-값 0.0001< 나타냅니다. (D) 균질화 후 CFU 수에 대한 배양 시간의 영향 테스트. 24 시간 배양 (n = 6) 및 48 시간 배양 (n = 12). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 는 p-값 0.0001< 나타냅니다. (E, F) 100x 배율(스케일 바 200μm)에서 변형된 그람 염색(E)으로 감염된 48시간 감염 후 난소 피부의 조직병리학적 분석의 대표적인 이미지. 상자는 1,000x 배율(50μm의 스케일 바)에서 (F)로 확대된 영역을 나타냅니다. 검은 색 화살표는 박테리아를 나타냅니다. (G,H) 100x 배율(스케일 바 200μm)에서 수정된 gGram 염색(G)으로 48시간 주기(대조군)에 따른 감염되지 않은 난소 피부의 조직병리학적 분석의 대표적인 이미지. 상자는 1,000x 배율(50μm의 스케일 바)에서 (H)로 확대된 영역을 나타냅니다. 통계 분석은 일원 분산 분석으로 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
항균제 개발은 중요하지만 비용이 많이 드는 벤처로 약 10억 달러의 비용이 들고 완료하는 데 약 15년이 걸릴 것으로 추정됩니다. 항균제 발견 및 항균제 효능에 대한 전임상 연구의 90% 이상이 학술 연구자 및일반적으로 직원이 50명 미만인 중소기업에 의해 수행됩니다22. 이 팀은 재정적으로 매우 제한되어 있어 번역 연구의 후기 단계에서 납 분자의 실패를 재앙으로 만듭니다. 항생제 내성의 증가는 새로운 항균제의 개발을 앞지르고 있으며, 이는 항균 연구에 대한 이미 제한된 투자를 책임감 있게 관리해야 할 필요성을 더욱 강화합니다.23.
생체 내 및 시험관 내 실험실 배양 간의 박테리아 생리학의 불균형은 리드 식별 단계에서 히트의 항균 효능을 과대 평가하는 경향이 있습니다. 이러한 과대 평가는 번역의 후속 단계에서 볼 수 있는 높은 이직률에 기여합니다. 생체 내 감염 중에 발견되는 생리학을 더 잘 모방한 생리학과 박테리아를 통합하는 체외 항균 효능 테스트 플랫폼을 사용할 수 있게 되면 항균 효능을 보다 정확하게 추정할 수 있고 연구자에게 비싸고 엄격하게 규제된 동물 실험에 의존하지 않고도 납 최적화를 더 잘 제어할 수 있습니다. 이러한 모델은 또한 번역의 후속 단계에서 소모율을 감소시키고 항균 약물 발견을 투자에 더 매력적으로 만들 수 있습니다.
여기에 설명된 이 난소 피부 감염 모델은 전임상 단계에서 새로운 국소 항균 제제의 효능을 테스트하기 위해 감염된 상처의 생리학적으로 관련된 시험관 내 모델을 연구자에게 제공하는 유용한 도구입니다. 과학 문헌 10,15,24,25,26,27,28에 기재된 대부분의 생체외 감염 모델과 대조적으로, 이 모델 에서, 생체외 조직에 노출된 병원체는 감염 동안 배양 배지 로 보충되지 않는다. 병원체 증식 및 후속 감염은 조직을 손상시키는 유기체의 능력에 달려 있습니다. 따라서, 이 모델에서 병원체 생리학은 종래의 미생물 배양에 비해 생체내 감염 동안의 생리와 더 밀접하게 관련된다. 배양 후 조직에서 회수된 CFU의 수로 판단되는 바와 같이 이 모델에서 재현성이 높은 감염이 얻어집니다.
인간 피부 등가물과 인간 및 돼지 생체 외 상처 모델이 너무 많기 때문에 이 모델에서 난소 조직의 사용은 표면적으로 한계라고 주장될 수 있습니다. 그러나, 양은 생체내29,30,31에서 감염의 모델로서 사용되는 큰 동물의 그룹에 속한다. 더욱이, 양은 면역학 연구 및 백신 개발에서 인간의 대리자로 사용되어 왔으며, 이는 그들의 면역 반응이 인간의 면역 반응과 유사하다는 것을 나타냅니다32. 상처 치유 중 조직 복구 과정은 양과 인간을 포함한 대형 포유류에서 유사하며33,34, 양에서 성공적으로 입증된 상처 치유를 개선하기 위한 중재가 인간에게로 번역하기 위해 제안되었습니다35,36,37. 따라서, 이러한 상처 모델에서 생체외 난소 피부의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 이러한 오바인 모델은 다음과 같은 이유로 인간 또는 돼지 피부를 통합한 모델에 대한 신뢰할 수 있는 대안으로 판단될 수 있다. 인간 피부의 가용성은 제한적이며 가능한 경우 다양한 품질입니다38. 조직 공학적 인간 표피 및 살아있는 피부 등가물은 조직 생리학에서 재현성을 보장하기 위해 배양 조건의 개선이 필요합니다39. 돼지 피부는 인간의 피부보다 접근하기 쉽지만, 널리 이용 가능한 돼지 피부는 표피10을 제거하는 도축장에서 시체 가공의 일부로서 화상을 입는다. 경험에 따르면 화상을 입지 않은 돼지 피부는 도축장에서 쉽게 구할 수 없습니다.
여기에 설명된 프로토콜 전체에는 모델의 성공을 보장하는 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 단계는 수확 후 조직의 살균입니다. 이산화 염소 용액은 조직 샘플과 혼합되어야하며 조직을 충분히 소독하고 오염 물질을 제거하기 위해 30 분의 접촉 시간을 허용해야합니다. 또한이 실험을 설정할 때 부적절한 취급 또는 소독제 및 항생제 배지를 사용한 비효율적 인 처리로 인해 탁도 또는 곰팡이 오염이 발생할 수 있습니다. 이 경우 탁도가 발생하는 샘플은 폐기해야합니다. 탁도와 오염의 발생을 줄이려면 인큐베이터를 자주 멸균하고 필터 팁을 사용하며 샘플과 함께 사용되는 도구 및 용기의 완전한 멸균을 보장하여 실험실 환경을 깨끗하게 유지해야합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 4mm 생검 펀치를 사용하여 조직을 감는 것입니다. 이 도구를 사용하면 프로토콜의 반복성과 재현성을 보장하기 위해 비슷한 크기의 상처 베드가 가능합니다. 상처 침대 크기의 가변성은 종말점 CFU에 영향을 미칩니다. 조직 플랩을 적절하게 제거하면 결과가 훨씬 더 일관됩니다. 종말점 CFU 계수의 무결성과 관련된 또 다른 중요한 단계는 박테리아 세포를 유리시키기 위해 미세한 팁 균질화기를 사용하는 것입니다. 균질화기 팁의 위치는 샘플에서 샘플로의 CFU 수에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 팁이 상처 베드에 직접 올바르게 배치되었을 때 샘플마다 보이는 변동성이 훨씬 적었습니다.
그럼에도 불구하고 여기에 제안 된 모델에는 제한이 없습니다. 이 모델은 모든 생체 외 연구에 내재 된 한계가 있습니다 (즉, 활성 혈관 흐름의 부족, 감염 진행을 조절할 수있는 공생 미생물의 부재 및 면역 세포의 부재). 생체 외 상처 모델은 활성 면역 세포를 포함하지 않기 때문에, 이들 세포의 존재 하에 생체 내에서 감염 진행은 생체외 모델에서 관찰되는 것과 다를 수 있다고 주장할 수 있다. 그럼에도 불구하고 생체 외 모델은 부착을 위한 조직 표면과 박테리아의 영양 공급원을 제공하고 제형에 3D 확산 장벽을 제시하여 기존 미생물학 배양 기술보다 항균 효능을 보다 정확하게 평가할 수 있습니다.
이 모델의 주요 장점은 조직이 인간 소비를 위해 재배되는 양에서 공급된다는 것입니다. 특히, 이 모델은 일반적으로 버려지는 어린 양의 머리에서 피부를 용도 변경합니다. 또한 이 모델은 처리량이 높으며 비용 효율적이고 신속하며 재현 가능한 비교 연구를 가능하게 합니다. 이 모델의 가용성은 보다 인도적인 연구 관행을 촉진하는 세 가지 R의 원칙에 따라 번역 연구를 위해 특별히 사육된 동물의 필요성을 줄이고 개선할 것이라고 주장할 수 있습니다. 여기에 설명된 모델은 S. 아우레우스 를 예시적인 병원체로 통합하지만, 이 모델은 다른 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 포함한 다른 미생물과 함께 사용될 수 있으므로 모델이 가능하게 하는 약물 개발의 범위를 넓힐 수 있습니다. 이 모델을 사용하면 연구자에게 전임상 단계에서 약물 설계 및 제형에 대한 더 큰 제어를 제공함으로써 피부 감염에 대해 절실히 필요한 항생제의 신속한 번역이 가능할 것으로 예상할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다
Acknowledgments
저자는 자금 지원에 대해 EPSRC(EP/R513313/1)에 감사드립니다. 저자는 또한 체스터필드 칼로우에 있는 R.B Elliot과 Son Abattoir에게 어린 양의 머리를 제공하고 프로젝트 초기 단계에서 매우 수용적인 것에 대해 감사하고, 이 프로토콜의 개발 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Kasia Emery, 조직학 샘플을 처리하고 이 프로젝트 전반에 걸쳐 매우 도움이 된 셰필드 대학의 감염, 면역 및 심혈관 질환 부서의 Fiona Wright에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
