Summary
本文介绍了东方果蝇背蝇CRISPR/Cas9诱变的分步方案。该标准化协议提供的详细步骤将作为产生突变果蝇的有用指南，用于背双歧杆菌的功能基因研究。
Abstract
东方果蝇 Bactrocera dorsalis 是一种高度侵入性和适应性的害虫物种，对柑橘和全球150多种其他水果作物造成损害。由于成年果蝇具有很强的飞行能力，雌性果蝇在果皮下产卵，因此需要直接接触害虫的杀虫剂通常在田间表现不佳。随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，许多科学家正在尝试制定环保的害虫管理策略。这些包括基于RNAi或基因编辑的杀虫剂，它们下调或沉默各种害虫中的基因（分子靶标），例如参与搜索行为的嗅觉基因。为了使这些策略适用于东方果蝇控制，需要有效的功能基因研究方法。在 背苜蓿 的存活和繁殖中具有关键功能的基因是基因敲低和/或沉默的良好分子靶标。CRISPR/Cas9系统是一种用于基因编辑的可靠技术，特别是在昆虫中。本文提出了一种系统 的方法，包括引导RNA的设计和合成、胚胎采集、胚胎注射、昆虫饲养和突变体筛选。这些协议将作为对背 侧双歧杆菌功能基因研究感兴趣的研究人员产生突变果蝇的有用指南。
Introduction
东方果蝇 Bactrocera dorsalis ，是一种世界性的害虫物种，对 150 多种水果作物造成损害，包括番石榴、芒果、尤金属、苏里南樱桃、柑橘、枇杷和木瓜1。仅在广东省（中国）造成的损失估计就超过2亿元人民币。成年雌性将卵插入成熟或成熟果实的皮下，导致果实腐烂和脱落，从而降低果实品质和作物总产量2。由于成年果蝇具有很强的飞行能力，它们的幼虫钻入果皮，因此需要直接接触害虫的杀虫剂在田间表现不佳。此外，杀虫剂的广泛使用增加了 背双歧杆菌 对各种农业化学品的抵抗力，使得控制这些有害害虫变得更加困难3。因此，迫切需要制定有效和环保的害虫管理策略。
最近，随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，科学家们正试图开发环境友好的害虫管理策略，例如RNAi，该策略针对各种害虫的重要基因（分子靶标）的功能。通过功能基因研究，可以鉴定出对害虫生存和繁殖至关重要的基因，并进一步作为改进专门针对性和环境友好型害虫管理工具的潜在分子靶标4。为了使这些策略适应东方果蝇控制，需要有效的功能基因研究方法。
CRISPR/Cas（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关）核酸内切酶系统最初是在细菌和古细菌中发现的，并发现是一种参与识别和降解外来细胞内DNA的适应性机制，例如通过感染噬菌体引入的机制5。在II型CRISPR系统中，Cas9核酸内切酶在小相关RNA（crRNA和tracrRNA）的引导下切割侵入DNA6，7，8，并已成为迄今为止使用最广泛的基因编辑工具之一9，10，11，12。由于CRISPR/Cas9系统具有基因沉默效率高、成本低等优点，因此已被应用于各种昆虫物种的基因编辑，包括埃及伊蚊13，14、蝗虫迁徙15和森16。在B. dorsalis中，与体色，翅膀二态性和性别决定相关的基因已经使用CRISPR / Cas917，18，19成功敲除。然而，CRISPR / Cas9在这种昆虫中应用的详细程序仍然不完整。此外，研究人员为背侧双歧杆菌基因编辑提供的一些步骤也各不相同，需要标准化。例如，Cas9的形式在已发表的参考文献17，18，19中是不同的。
本文提供了利用CRISPR/Cas9系统诱变背 苜蓿 的系统方法，包括引导RNA的设计和合成、胚胎采集、胚胎注射、昆虫饲养和突变体筛选。该协议将作为对 背侧双歧杆菌功能基因研究感兴趣的研究人员产生突变苍蝇的有用指南。
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Protocol
1. 靶标设计与sgRNA的 体外 合成
- 通过背侧双歧杆菌基因组的生物信息学分析，预测感兴趣的靶基因的结构并确定外显子和内含子之间的边界（此处使用的软件应用程序列在材料表中）。
注意：BLAT20 用于搜索基因组中潜在的基因位点。使用Hisat221将高质量的RNA-seq读数（转录组）与获得的基因位点对齐。Samtools22 用于生成排序的bam文件。将排序后的 bam 文件输入到 Stringtie223 以提供汇编脚本。组装转录本和基因位点信息由Transdecoder24组合。从Transdecoder获得的结果在IGV工具25 中可视化，并且可以确定外显子和内含子之间的边界。 - 确定候选靶基因位点内的合适靶区。总长度必须小于750 bp，以便更方便地进行测序（图1B）。设计特异性引物以通过PCR扩增野生型基因组DNA的靶区（图1B）（引物：F引物：AACATTGAATCTGGAATCAGGTAAACT，R引物：CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC）。将PCR产物克隆到钝端载体26中，并选择20 个单独的细菌菌落进行测序，以确定目标区域在实验室昆虫种群中的保守程度。
- 典型的靶位点包含一个三核苷酸序列基序（NGG 或 CCN）和一个与 NGG 或 CCN 基序相邻的 20 bp 序列（20 bp-NGG 或 CCN-20 bp）。针对 背侧双歧杆菌 基因组对候选靶位点进行爆破，并确保预测效率足够高且脱靶率低;一些开源软件程序可以自动预测这一点。在该协议中，sgRNAcas9 -AI27 用于选择和评估最佳靶标。使用细节可以在该软件的手册中找到。
注意：可能的目标位点靠近靶基因的5' UTR和20 bp序列开始时的1-2 Gs。为了实现通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定的大缺失，建议设计两个相隔超过100 bp的靶标28 （图1C）。 - 使用市售的 gRNA 合成试剂盒生成设计的 sgRNA。按照用户指南执行每个步骤。将gRNA产物重悬于无核酸酶的水中，使用紫外-可见分光光度计定量浓度，并在使用前储存在-80°C（使用此处使用的试剂盒成功合成的单个gRNA [10μL]的浓度约为4000-6000ng / μL，甚至更高）。
注意：虽然产生突变果蝇是每个研究人员的第一步，但下游实验/分析的适当阴性对照至关重要。与突变体一起生成这些对照可以节省研究人员的时间和精力。例如，将加扰的sgRNA设置为阴性对照。
2. 胚胎采集和准备
- 将B . dorsalis pupa放入塑料笼中。在成虫关闭后，提供糖和酵母（1：1）的混合物作为食物以及水源（图2A，B）。饲养条件为55%相对湿度（RH），26.5°C和14：10 L/D循环（早上六点开灯，晚上八点关灯）。
- 大多数成虫在出苗后10天达到性成熟。提供一个合适的环境，帮助成年苍蝇尽可能多地交配。理想情况下，使用30-50勒克斯的灯架。这可以提高雌性的繁殖力，从而提高胚胎收集的效率。
注意：将成虫（出苗后5-6天）放在昏暗（<100勒克斯）的环境中可以促进交配。一般来说，产卵高峰发生在下午 03：00（14：10/L：D，早上 06：00 开灯，晚上 08：00 熄灯）;为了获得足够的胚胎，建议在下午03：00之前30分钟将产卵室放入笼子中。 - 将一块200目纱布放在产卵室中，距离腔室盖1-2毫米。这将有助于获得尽可能多的胚胎。
注意：避免让胚胎浸泡在橙汁中或用纱布擦拭，因为这会显着降低胚胎的存活率。 - 当显微注射装置准备就绪时，将新的产卵室放入笼中。用细湿刷每10分钟收集一次胚胎，然后将它们排列在自制的注射板上（长55毫米，宽13.75毫米，高5毫米的有机玻璃，中间开一个45毫米x 5毫米x 0.3毫米的浅槽，以方便放置卵子）。如果胚胎具有高内部压力，则可选择在<10%RH下轻微干燥10分钟。在注射过程中将胚胎浸入卤烃油中以避免进一步干燥（图2C）。
3.胚胎显微注射
- 使用微量移液器拉拔器准备玻璃注射针。
注意：按照用户指南设置参数非常重要。在这些方案中，可以使用微量移液器拉拔器手册建议的参数制作不同的针头形状。玻璃毛细管必须尽可能清洁，以防止灰尘堵塞针头。 - 准备工作溶液。将Cas9蛋白和相应的sgRNA混合至以下工作浓度：sgRNA，300ng / μL;Cas9 蛋白，150 ng/μL.向混合物中加入 1 μL 酚红，作为标记注射胚胎的便捷方法。将制备好的混合物放在冰上以避免sgRNA降解。
注意：使用无核酸酶移液器吸头和PCR管。Cas9蛋白的浓度需要小于或等于150ng/μL;较高的浓度是有毒的，会显着降低胚胎存活率。Cas9也可以以DNA或mRNA格式递送，以实现成功的基因编辑17，19。在该协议中，推荐使用Cas9蛋白，因为mRNA易于降解，并且质粒DNA中Cas9蛋白的表达需要时间来转录和翻译。 - 设置喷油器的参数。初始程序是Pi-500 hPa，Ti-0.5 s和PC-200 hPa。在显微注射过程中根据需要进一步调整这些参数。
- 将 3 μL 混合物加入进样针中。避免引入可能堵塞针头的气泡。使用微型研磨机打开针头。
- 根据用户指南将针头连接到显微操纵器（图2E）。
- 将带有排列胚胎的盘子放在物镜桌上。在精细光学显微镜下调整微量移液器的位置，将微量移液器和胚胎设置在同一平面上。通过踩下踏板调节液滴体积;建议胚胎体积的1/10。
- 将针尖插入胚胎的后部（植物极）。通过从注射器踩下踏板将混合物输送到胚胎中。如果添加酚红，则会立即观察到略带红色的颜色。
注意：来自针孔的少量细胞质回流不会降低胚胎的存活率。注射200个胚胎足以成功诱变一个基因。添加更多的卤烃油浸泡胚胎可以防止进一步干燥。注射需要在极细胞形成之前进行，这确保了每个突变都可以有效地遗传。
4. 注射后昆虫饲养
- 将装有注射胚胎的注射板放入保持在55%RH，26.5°C和14：10 L / D循环的人工气候室中（早上六点开灯，晚上八点熄灯）。
- 注射后，胚胎形成通常需要24小时才能完成，36小时才能孵化。使用细尖刷将幼虫转移到准备好的幼虫饮食中。每天收集幼虫三到四次，直到不再有幼虫孵化。一般来说，幼虫需要2-3天才能完成孵化，并在7天内化蛹。
注意：使用以玉米为基础的饮食来喂养幼虫。该食谱包含 150 克玉米粉、150 克香蕉、0.6 克苯甲酸钠、30 克酵母、30 克蔗糖、30 克纸巾、1.2 毫升盐酸和 300 毫升水29.尽量减少幼虫留在油中的时间（<2小时）。尽可能在孵化后立即将幼虫移到饮食中。这可以显着提高存活率和化蛹率。不要提供过多的饮食（90毫米培养皿的2/3的饮食足以容纳30只幼虫）;否则会发霉，降低幼虫存活率。 - 将成熟的幼虫放入湿沙中化蛹。化蛹阶段大约需要10天。在闭合开始之前将蛹移到塑料笼中。
5. 突变体筛选
- 突变体筛选的流程图如图 3A所示。通过显微注射获得的G0成虫与野生型成虫杂交以获得杂合系。通过基因分型验证后代（G1）携带的突变类型。
- 具有相同突变基因型的自交G1以获得G2中的纯合子系。如果G1中突变体的基因型完全不同，则将杂合子与野生型苍蝇杂交。纯合子系通常在G3中获得。保留两个或三个纯合子系，用于后续的表型实验。
- 使用来自新鲜蛹或单个成虫中腿的基因组DNA进行基因分型。设计特异性引物以扩增靶标区域;引物必须在靶位点的上游和下游设置至少50 bps。有关入门详细信息，请参阅步骤 1.2。
注意：由于蛹中的DNA含量极低，因此建议使用市售的DNA提取试剂盒。 - 使用以下循环条件进行PCR：98°C3分钟，然后35个98°C循环10秒，15秒，退火温度适合设计的引物，72°C35秒，然后最终延伸72°C10分钟。
- 对纯化的PCR产物进行测序。当检测到与靶位点相邻的多个重叠峰时（图3B），发生了成功的诱变。将纯化的PCR产物亚克隆到平端载体中，并选择10个单独的细菌菌落进行测序，以验证突变体的基因型。保持具有移码突变和过早翻译终止的线条（图 3C）。
注意：无需执行单克隆测序来验证G0个体的基因型。只需对PCR产物进行测序，并保持与靶位点相邻的明显多个重叠峰的个体。初始注射后，建议选择10个胚胎提取基因组DNA，并根据步骤5.3中的标准对PCR产物进行测序。这有助于提前预测突变率。在这项研究中，确定基因型的桑格测序是由一家测序公司完成的。
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Representative Results
该协议提供了使用CRISPR / Cas9技术开发背 侧双歧杆菌 突变体的详细步骤，包括gDNA选择，收集胚胎和显微注射，昆虫维持和突变体筛选的代表性结果。
所选基因的靶位点的示例位于第三个外显子中（图1C）。该位点高度保守，通过凝胶电泳检测合成gRNA的DNA模板（图1D）和体 外 转录获得的gRNA的单条带（图1E）。
如第3节所述，将注射到200个新鲜收获的鸡蛋中。按照步骤4.1-4.3中描述的方案维持胚胎。通过对PCR产物进行测序检测到，80%的G0个体是镶嵌突变体（表1）。在这里，选择了具有8 bp缺失的突变体，导致G1中氨基酸翻译过早终止（图3C）。这应该导致该基因产物在 背侧双歧杆菌中的相应功能发生变化。将选定的G1与野生型杂交，得到G2杂合子。自杂交G2杂合子和纯合子在下一代中被回收，表明该方案成功开发背 双歧杆菌 突变体，并且可以更广泛地应用于该物种和密切相关物种的功能基因研究。
图1：sgRNA的制备 。 （A）sgRNA制备的一般程序。（B）通过gDNA的PCR扩增的目标区域（100 bp）。（C）Cas9靶基因结构和靶切割位点示例。（D）sgRNA的PCR组装（~100 bp）。（E）通过 体外 转录和纯化合成sgRNA。 请点击此处查看此图的大图。
图2：胚胎显微注射 。 （一）注射过程和方法。（二）胚胎采集装置，在纱布上产卵。（C）将胚胎与水对齐并用卤烃油覆盖。（D） 微量移液器拉拔器。（五）显微注射系统的整个设置。显微镜（左）、显微注射器和显微操纵器（中）和自动气泵（右）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：突变体筛选 。 （A）突变体的交配和纯合子的获取。（B）来自突变基因组的PCR产物，其在靶标处产生一组不同的峰。（C）突变类型和氨基酸变化之一。缺失突变导致翻译过早终止。缩写：HE = 杂合子，HO = 纯合子。对照：胚胎注射加扰的sgRNA。 请点击此处查看此图的大图。
| 注射混合 | 注射胚胎 | 孵化幼虫 | 蛹 | 马赛克 G0 | ||
| （马赛克/成人总数） | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 （300 纳克/微升） | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 （300 纳克/微升） | ||||||
| Cas9 （150 纳克/微升） | ||||||
| 酚红（1 μL） | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 （300 ng/μL） | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 （300 ng/μL） | ||||||
| Cas9 （150 纳克/微升） | ||||||
| 酚红（1 μL） | ||||||
表1：显微注射后 背双歧杆菌 存活和诱变。
| 问题 | 潜在原因 | 解决 方案 | |
| 胚胎收集效率低下 | 1. 成年人状况不佳 | 1.确保食物和水的供应，特别是食物的含糖量。 | |
| 2. 配接不足 | 2.在30-50勒克斯昏暗条件下提前配接。最好选择12-15天大的交配成虫。 | ||
| 注射后种蛋孵化率差 | 1. 劣质胚胎 | 1.采摘新鲜丰满的鸡蛋，用浸水的刷子轻轻刷洗。 | |
| 2.针头不合适 | 2.针尖尽可能小，以尽量减少注射时对鸡蛋的伤害。 | ||
| 3.注射后种蛋饲养不当 | 3.鸡蛋注射后需要保持水分，防止脱水变干。注射后，鸡蛋也可以直接转移到食物中。 | ||
| 幼虫成活率低 | 1.发霉的食物不适合幼虫生长 | 1.对于新孵化的幼虫，添加少量食物。过多的食物会发霉或变干，影响幼虫的生长。 | |
| 2.新孵化的幼虫长时间浸泡在油中 | 2.新孵化的幼虫需要及时转移到幼虫食物中或注射后直接采卵到食物中。 | ||
| 成人突变率低 | 1. 低质量的 gRNA | 1.严格的实验操作，合成高质量的gRNA，防止降解。 | |
| 2. 低效目标导致脱靶 | 2. 筛选我们的讨论提到的高效目标。 | ||
表 2：构建突变体的可能问题、潜在原因和解决方案。
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Discussion
CRISPR/Cas9系统是使用最广泛的基因编辑工具，具有多种应用，如基因Threpy30，作物育种31和基因功能的基础研究32。该系统已被应用于各种昆虫物种的基因编辑，并已成为害虫功能基因研究的有效工具。我们在这里介绍的方案标准化了引导RNA的设计和合成，收集胚胎，胚胎注射，昆虫饲养和突变体筛选的过程。此外，还增加了一个故障排除表来总结每个步骤的潜在问题，并提供他们的解决方案以减轻工作量并提高效率（表2）。该程序提供了一种可靠的方法来编辑感兴趣的基因，并改善了背双歧杆菌的功能基因组研究。
首先，靶基因选择对于提高CRISPR/Cas9系统的效率至关重要，ChopChop 33，34（http://chopchop.cbu.uib.no/）、sgRNAcas9（V3.0）35和CRISPR最优靶标查找器36（http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu）等几个开源软件程序可以自动生成靶标并预测潜在的脱靶率。由于背芽孢杆菌的高繁殖率有助于胚胎收集，因此可以通过牺牲一部分胚胎进行DNA提取和目标区域的测序来预测突变率。如果实验室中没有测序，还建议使用T7核酸内切酶I来预测突变率37。通过这三种方法可以选择基因组缺失率高的靶位点，从而提高背侧双歧杆菌的基因编辑效率。
胚胎的发育阶段决定了突变是否会遗传。为了获得遗传突变，基因编辑必须在生殖细胞中进行。通常，sgRNA和Cas9的混合物在极细胞形成后不能递送到生殖细胞中。在背芽孢杆菌中，极细胞形成发生在产卵38后3小时，而这里详细介绍的背双歧杆菌方案从胚胎收集到显微注射结束需要30分钟。在注射过程中，胚胎的植物端几乎没有形成极细胞;因此，在G0中获得的基因突变应该被有效地遗传。显微注射所消耗的时间也少于先前发表的论文中提到的方法（一般为1-3小时）18，19。
在胚胎收集和处理过程中尽量减少机械或化学损伤非常重要。用细刷轻轻地将胚胎排列在注射板上。注射位置应反映以前在果蝇（方法-尼古拉斯·贡佩尔的实验室，http://gompel.org/methods）和头蝇39中所做的工作。在植物极注射胚胎;切勿将针头插入动物杆。按照微量移液器拉拔器导轨准备针头;针的开口应尽可能小，以避免过多的细胞质回流。已发表的背侧双歧杆菌研究中提到的方法通常用次脊髓酸钠17，18，19对胚胎进行去皮;这可能会导致化学损伤并降低胚胎的存活率。在这个协议中，胚胎没有去皮，注射仍然效果很好。对胚胎的化学损伤可能很小。
注射后养虫非常重要。这里提供的标准化饲养方案可以作为饲养其他果蝇物种的参考，特别是 Bactrocera 物种。胚胎可以浸入油中，以避免使用我们自制的注射板在注射过程中干燥。尽量减少幼虫在油中花费的时间（<2小时），以达到G0的存活率超过50%。
建议使用非侵入性基因组DNA提取方法进行突变体检测。例如，一些鳞翅目动物研究人员认为，最终龄幼虫的分泌物可用于提取基因组DNA以进行进一步的基因分型。对于背双歧杆菌，一种非侵入性方法涉及从新鲜的蛹中提取基因组DNA。注射靶向标记基因和目的基因的多种sgRNA也可以改善突变体的鉴定。例如，共同注射靶向眼睛颜色（kmo）和幼年激素受体（Met）的sgRNA可以在蚊子中产生75%具有双重突变的后代。根据幼虫37的眼睛颜色初步筛选Met突变体。这应该在未来的背侧双歧杆菌中进行评估，以通过使用CRISPR / Cas9系统进一步提高该昆虫物种的基因编辑功效。
总之，CRSIPR/Cas9系统是背 双歧杆菌功能基因组学的有力工具。我们详细的实验方案提供了有用的信息，帮助研究人员实现高效的胚胎收集、理想的幼虫存活率和所需的编辑效率。这可能是帮助研究人员获得背 双歧杆菌 诱变的一种简单快捷的方法。该技术无法应用于致死基因的功能研究，因为遗传突变需要成功的杂交育种。未来的研究可以集中在开发转基因工具来表达阶段或组织特异性CRISPR元件，以突破这一限制。
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Disclosures
作者没有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了深圳市科技计划（批准号：KQTD20180411143628272）和深圳市大鹏新区科技创新与产业发展专项资金（批准号：PT202101-02）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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