Summary
Dette papir præsenterer de trinvise protokoller for CRISPR / Cas9 mutagenese af den orientalske frugtflue Bactrocera dorsalis. Detaljerede trin fra denne standardiserede protokol vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer til funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Abstract
Den orientalske bananflue, Bactrocera dorsalis, er en meget invasiv og adaptiv skadedyrsart, der forårsager skade på citrus og over 150 andre frugtafgrøder verden over. Da voksne frugtfluer har stor flyvekapacitet, og kvinder lægger deres æg under frugtskindene, fungerer insekticider, der kræver direkte kontakt med skadedyret, normalt dårligt i marken. Med udviklingen af molekylærbiologiske værktøjer og high-throughput sekventeringsteknologi forsøger mange forskere at udvikle miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Disse omfatter RNAi eller genredigeringsbaserede pesticider, der nedregulerer eller tavser gener (molekylære mål), såsom olfaktoriske gener involveret i søgeadfærd, i forskellige skadedyr. For at tilpasse disse strategier til orientalsk bananfluekontrol er der behov for effektive metoder til funktionel genforskning. Gener med kritiske funktioner i overlevelse og reproduktion af B. dorsalis tjener som gode molekylære mål for gennedslag og / eller hæmning. CRISPR/Cas9-systemet er en pålidelig teknik, der anvendes til genredigering, især i insekter. Dette papir præsenterer en systematisk metode til CRISPR / Cas9 mutagenese af B. dorsalis, herunder design og syntese af guide RNA'er, indsamling af embryoner, embryoinjektion, insektopdræt og mutant screening. Disse protokoller vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer for forskere, der er interesseret i funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Introduction
Den orientalske frugtflue, Bactrocera dorsalis , er en kosmopolitisk insektskadedyrsart, der forårsager skade på over 150 arter af frugtafgrøder, herunder guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirsebær, citrus, loquat og papaya1. Skaden forårsaget i Guangdong-provinsen (Kina) alene anslås til over 200 millioner yuans. Voksne kvinder indsætter deres æg under huden af modne eller modne frugter, hvilket forårsager forfald og abscission af frugten, hvilket reducerer frugtkvaliteten og det samlede udbytte af afgrøden2. Da voksne bananfluer har stor flyvekapacitet, og deres larver borede sig ind i frugthuden, fungerer insekticider, der kræver direkte kontakt med skadedyret, dårligt i marken. Derudover har den omfattende anvendelse af insekticider øget B. dorsalis resistens over for forskellige landbrugskemikalier, hvilket gør bekæmpelsen af disse skadelige skadedyr endnu vanskeligere3. Derfor er der desperat behov for udvikling af effektive og miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier.
For nylig, med udviklingen af molekylærbiologiske værktøjer og high-throughput sekventeringsteknologier, forsøger forskere at udvikle miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier, såsom RNAi, der er målrettet mod funktionaliteten af vigtige gener (molekylære mål) for forskellige skadedyr. Gener, der er kritiske for skadegørerens overlevelse og reproduktion, kan identificeres gennem funktionelle genundersøgelser og tjener yderligere som potentielle molekylære mål for forbedring af specifikt målrettede og miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesværktøjer4. For at tilpasse sådanne strategier til orientalsk bananfluekontrol er der behov for effektive metoder til funktionel genforskning.
CRISPR/Cas (grupperet regelmæssigt interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associeret) endonukleasesystem blev oprindeligt opdaget i bakterier og arkæer og viste sig at være en adaptiv mekanisme involveret i genkendelse og nedbrydning af fremmed intracellulært DNA, såsom det, der blev introduceret ved at inficere bakteriofager5. I type II CRISPR-systemet styres Cas9-endonuklease af små associerede RNA'er (crRNA og tracrRNA) for at spalte indtrængende DNA 6,7,8 og er blevet et af de mest anvendte værktøjer til genredigering til dato9,10,11,12. Da CRISPR/Cas9-systemet har flere fordele, såsom høj effektivitet af genhæmning og lave omkostninger, er det allerede blevet anvendt til genredigering i forskellige insektarter, herunder Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 og Bombyx mori16. I B. dorsalis er gener relateret til kropsfarve, vingedimorfisme og kønsbestemmelse med succes blevet slået ud ved hjælp af CRISPR / Cas917,18,19. Detaljerede procedurer for CRISPR/Cas9-anvendelse i dette insekt er dog stadig ufuldstændige. Desuden er nogle trin fra forskere til B. dorsalis genredigering også varierede og har brug for standardisering. For eksempel var formerne for Cas9 forskellige i offentliggjorte referencer17,18,19.
Dette papir giver en systematisk metode til mutagenese af B. dorsalis ved hjælp af CRISPR / Cas9-systemet, herunder design og syntese af guide-RNA'er, indsamling af embryoner, embryoinjektion, insektopdræt og mutantscreening. Denne protokol vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer for forskere, der er interesseret i de funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måldesign og in vitro-syntese af sgRNA
- Forudsig strukturen af målgener af interesse og bestem grænserne mellem exoner og introner via bioinformatisk analyse af B. dorsalis-genomet (softwareapplikationer, der anvendes her, er angivet i materialetabellen).
BEMÆRK: BLAT20 blev brugt til at søge potentielle genloki i genomet. RNA-seq-læsningerne af høj kvalitet (transkriptom) blev justeret til de erhvervede genloki ved hjælp af Hisat221. Samtools22 blev brugt til at generere de sorterede bam-filer. De sorterede bam-filer blev indtastet til Stringtie223 for at give samlingsudskrifterne. Samlingstransskriptionerne og genlokioplysningerne blev kombineret af Transdecoder24. Resultaterne erhvervet fra Transdecoder blev visualiseret i IGV-værktøjer25 , og grænserne mellem exoner og introns kunne bestemmes. - Identificer de egnede målregioner inden for kandidatmålgenstedet. Den samlede længde skal være mindre end 750 bp for mere bekvem sekventering (figur 1B). Design specifikke primere til at forstærke målområdet fra vildtype genomisk DNA ved PCR (figur 1B) (Primere: F-primer: AACATTGAATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Klon PCR-produkterne i en stump slutvektor26 og vælg 20 individuelle bakteriekolonier til sekventering for at bestemme, hvor bevaret målområdet er i laboratorieinsektpopulationerne.
- Et typisk målsted indeholder et tre-nukleotidsekvensmotiv (NGG eller CCN) og en 20 bp-sekvens ved siden af NGG- eller CCN-motiverne (20 bp-NGG eller CCN-20 bp). Spræng kandidatens målsteder mod B. dorsalis-genomet , og sørg for, at den forudsagte effektivitet er høj nok, og at målretningsraten er lav; Flere open source-softwareprogrammer kan automatisk forudsige dette. I denne protokol bruges sgRNAcas9 -AI27 til at vælge og evaluere de optimale mål. Detaljer om brug kan findes i manualen til denne software.
BEMÆRK: Mulige målsteder lukket for 5 'UTR af målgenet og 1-2 G'er i starten af 20 bp-sekvensen foretrækkes. For at opnå en stor sletning, som vil blive identificeret ved PCR efterfulgt af agarosegelelektroforese, anbefales det at designe to mål28 adskilt af over 100 bp (figur 1C). - Brug det kommercielt tilgængelige gRNA-syntesesæt til at generere det designede sgRNA. Udfør hvert trin ved at følge brugervejledningen. GRNA-produktet resuspenderes i nukleasefrit vand, koncentrationen ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer og opbevares ved -80 °C inden brug (koncentrationen af vellykket syntetiseret enkelt gRNA [10 μL] med det sæt, der anvendes her, er ca. 4000-6000 ng/μL eller endnu højere).
BEMÆRK: Selvom generering af mutantfluer er det første skridt for enhver forsker, er den passende negative kontrol til downstream-eksperiment / analyse kritisk. Generering af disse kontroller sammen med mutanterne sparer forskere tid og kræfter. For eksempel sæt krypteret sgRNA som en negativ kontrol.
2. Embryonindsamling og -forberedelse
- Placer B. dorsalis pupper i plastikbure. Giv en blanding af sukker og gær (1: 1) som mad sammen med en vandkilde, efter at de voksne er lukket (figur 2A, B). Opdrætsforholdene er 55% relativ luftfugtighed (RH), 26,5 ° C og en 14:10 L / D-cyklus (lys tændt klokken seks om morgenen, lys slukket klokken otte om aftenen).
- De fleste voksne når seksuel modenhed 10 dage efter fremkomsten. Sørg for et passende miljø for at hjælpe voksne fluer med at parre sig så meget som muligt. Ideelt set skal du bruge et lysstativ med et lys på 30-50 lux. Dette kan forbedre kvindens fecundity og dermed forbedre effektiviteten af embryoindsamling.
BEMÆRK: At sætte de voksne (i alderen 5-6 dage efter fremkomsten) i et svagt oplyst (<100 lux) miljø kan fremme parring. Generelt sker toppen af oviposition kl. 03:00 (14:10 / L: D, lys på 06:00, lys slukket kl. 08:00); For at få nok embryoner anbefales det at placere ovipositionskamre i burene 30 minutter før kl. 15.00. - Placer en 200-mesh gasbind i ovipositionskammeret, 1-2 mm væk fra kammerlåget. Dette vil hjælpe med at opnå så mange embryoner som muligt.
BEMÆRK: Undgå at lade embryonerne blive gennemblødt i appelsinsaft eller gnides med gasbind, da dette kan reducere embryonernes overlevelsesrate betydeligt. - Sæt et nyt ovipositionskammer i buret, når mikroinjektionsopsætningen er klar. Saml embryonerne hvert 10. minut ved hjælp af en fin våd børste, og stil dem derefter op på en selvfremstillet injektionsplade (plexiglas med en længde på 55 mm, en bredde på 13,75 mm og en højde på 5 mm, A 45 mm x 5 mm x 0,3 mm lav rille åbnes i midten for at lette ægplacering). Hvis embryonerne har højt indre tryk, er let udtørring ved <10% RH i 10 minutter valgfrit. Dyp embryonerne i halocarbonolie under injektionen for at undgå yderligere udtørring (figur 2C).
3. Mikroinjektion af embryoet
- Forbered glasinjektionsnålen ved hjælp af en mikropipettetrækker.
BEMÆRK: Det er vigtigt at indstille parametrene efter brugervejledningen. I disse protokoller kan forskellige nåleformer fremstilles ved hjælp af de parametre, der er foreslået af manualen til mikropipettetrækkeren. Glaskapillæren skal være så ren som muligt for at forhindre støv i at tilstoppe nålen. - Forbered arbejdsløsningen. Bland Cas9-proteinet og det tilsvarende sgRNA til følgende arbejdskoncentrationer: sgRNA, 300 ng / μL; Cas9 protein, 150 ng/μL. Tilsæt 1 μL phenolrød til blandingen for at tjene som en bekvem måde at markere injicerede embryoner på. Anbring den tilberedte blanding på is for at undgå nedbrydning af sgRNA'et.
BEMÆRK: Brug nukleasefri pipettespidser og PCR-rør. Koncentrationen af Cas9-protein skal være mindre end eller lig med 150 ng/μL; højere koncentrationer er giftige og reducerer embryooverlevelsesraten betydeligt. Cas9 kunne også leveres i DNA- eller mRNA-format for at opnå vellykket genredigering17,19. I denne protokol anbefales Cas9-protein, da mRNA'er er modtagelige for nedbrydning, og ekspressionen af Cas9-protein fra plasmid-DNA tager tid til transkription og translation. - Indstil parametrene for injektoren. Det oprindelige program er Pi-500 hPa, Ti-0.5 s og PC-200 hPa. Juster disse parametre yderligere efter behov under mikroinjektion.
- Tilsæt 3 μL af blandingen i injektionsnålen. Undgå at indføre luftbobler, der muligvis kan tilstoppe nålen. Åbn nålen ved hjælp af en Microgrinder.
- Tilslut nålen til mikromanipulatoren i henhold til brugervejledningen (figur 2E).
- Sæt pladen med opstillede embryoner på målbordet. Juster mikropipettens position under et fint optisk mikroskop, og sæt mikropipetten og embryoet på samme plan. Juster dråbevolumen ved at trykke på pedalen; 1/10 mængden af embryoner anbefales.
- Indsæt nålespidsen i embryoets bageste (vegetabilske pol). Lever blandingerne i embryoet ved at trykke på pedalen fra injektoren. Hvis phenolrød tilsættes, observeres en let rødlig farve med det samme.
BEMÆRK: Et lille volumen cytoplasmatisk tilbagestrømning fra pinhole vil ikke reducere embryoets overlevelsesrate. Injektion af 200 embryoner er nok til vellykket mutagenese af et gen. Tilsætning af mere halocarbonolie for at nedsænke embryonerne kan forhindre yderligere udtørring. Injektionen skal udføres før polcelledannelse, hvilket sikrer, at hver mutation effektivt kan arves.
4. Insektopdræt efter injektion
- Injektionspladen med de injicerede embryoner anbringes i et kunstigt klimakammer, der holdes ved 55 % RH, 26,5 °C og en cyklus på 14:10 L/D (lyser klokken seks om morgenen, lyset slukkes klokken otte om aftenen).
- Efter injektion tager embryodannelsen normalt 24 timer at fuldføre og 36 timer at luge. Brug en børste med fin spids til at overføre larverne til en tilberedt larvediæt. Saml larver tre eller fire gange dagligt, indtil der ikke klækkes flere larver. Generelt tager larver 2-3 dage at afslutte udklækning og forpupper sig inden for 7 dage.
BEMÆRK: En majsbaseret kost blev brugt til at fodre larverne. Opskriften indeholder 150 g majsmel, 150 g banan, 0,6 g natriumbenzoat, 30 g gær, 30 g saccharose, 30 g papirhåndklæde, 1,2 ml saltsyre og 300 ml vand29. Minimer den tid, larverne er tilbage i olie (<2 timer). Flyt larverne til kosten umiddelbart efter udklækning så vidt muligt. Dette kan øge overlevelses- og hvalperaterne betydeligt. Giv ikke for meget kost (en diæt med 2/3 af en 90 mm petriskål er nok til 30 larver); Ellers bliver det muggent og reducerer larvens overlevelsesrate. - Sæt de modne larver i det våde sand for at forpuppe sig. Forpupningsstadiet tager cirka 10 dage. Flyt pupperne til plastikbure, før eclosion begynder.
5. Mutant screening
- Et rutediagram over mutantscreeningen er illustreret i figur 3A. Cross G0 voksne opnået ved mikroinjektion med vildtype voksne for at opnå heterozygote linjer. Kontroller den type mutationer, som afkommet (G1) bærer ved genotypning.
- Selvkrydsning af G1 med den samme mutante genotype for at opnå homozygote linjer i G2. Hvis genotyperne af mutanterne i G1 er helt forskellige, skal du krydse heterozygoterne med vildtypefluer. Homozygote linjer opnås normalt i G3. Oprethold to eller tre homozygote linjer til efterfølgende fænotypeforsøg.
- Brug det genomiske DNA fra et frisk puparium eller et enkelt midterben hos individuelle voksne til at udføre genotypning. Design specifikke primere for at forstærke målområdet; Primerne skal indstille mindst 50 bps opstrøms og nedstrøms for målstedet. Se trin 1.2 for primerdetaljerne.
BEMÆRK: Da mængden af DNA i et puparium er ekstremt lav, anbefales kommercielt tilgængelige DNA-ekstraktionssæt. - PCR udføres under følgende cyklusforhold: 98 °C i 3 minutter efterfulgt af 35 cyklusser på 98 °C i 10 s, 15 s ved en udglødningstemperatur, der passer til de designede primere, 72 °C i 35 s, efterfulgt af en endelig forlængelse på 72 °C i 10 min.
- Sekvenser de rensede PCR-produkter. Når der opdages flere overlappende toppe ved siden af målstedet (figur 3B), er der sket vellykket mutagenese. Underklon de oprensede PCR-produkter til en stump-ende vektor og vælg 10 individuelle bakteriekolonier til sekventering for at verificere mutanternes genotype. Vedligehold linjerne med frameshift-mutationer og for tidlige oversættelsesafslutninger (figur 3C).
BEMÆRK: Der er ikke behov for at udføre enkeltklonsekventering for at verificere genotypen af G0-individer. Bare sekventer PCR-produkterne og vedligehold individerne med åbenlyse flere overlappende toppe ved siden af målstedet. Efter den første injektion anbefales det at vælge 10 embryoner til ekstraktion af genomisk DNA og sekventering af PCR-produkterne baseret på standarderne i trin 5.3. Dette kan hjælpe med at forudsige mutationshastigheder på forhånd. I denne undersøgelse blev sanger-sekventering for at bestemme genotypen udført af et sekventeringsfirma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol præsenterer detaljerede trin til udvikling af B. dorsalis-mutanter ved hjælp af CRISPR / Cas9-teknologi, herunder repræsentative resultater fra gDNA-udvælgelse, indsamling af embryoner og mikroinjektion, insektvedligeholdelse og mutantscreening.
Eksemplet på målstedet for det valgte gen er placeret i den tredje exon (figur 1C). Dette sted er meget bevaret, og et enkelt bånd blev detekteret ved gelelektroforese for DNA-skabelonen for syntetisk gRNA (figur 1D) og gRNA opnået ved in vitro-transkription (figur 1E).
Injektion i 200 friskhøstede æg blev udført som beskrevet i punkt 3. Embryonerne blev vedligeholdt ved at følge protokollerne beskrevet i trin 4.1-4.3. Som påvist ved sekventering af PCR-produkterne er 80% af G0-individerne mosaikmutanter (tabel 1). Her blev mutanter med 8 bp deletion, hvilket resulterede i for tidlig afslutning af aminosyretranslation i G1, udvalgt (figur 3C). Dette bør føre til ændringer i de tilsvarende funktioner af dette genprodukt i B. dorsalis. Den valgte G1 blev krydset med vildtype for at opnå G2 heterozygoter. Selvkrydsning af G2 heterozygoter og homozygoter blev genoprettet i den næste generation, hvilket viser, at denne ordning er vellykket til udvikling af B. dorsalis mutanter og kunne anvendes mere bredt i funktionelle genundersøgelser i denne og nært beslægtede arter.
Figur 1: Fremstilling af sgRNA . (A) Generelle procedurer for sgRNA-forberedelse. (B) Målområde forstærket af PCR fra gDNA (100 bp). (C) Eksempel på målgenstruktur og målspaltningssted af Cas9. (D) PCR-samling af sgRNA (~ 100 bp). (E) Syntese af sgRNA ved in vitro transkription og oprensning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Embryo mikroinjektion . (A) Processen og metoden til injektion. B) Udstyr til indsamling af embryoner, æglægning på gaze. (C) Sæt embryoner op med vand og dæk med halocarbonolie. (D) Micropipette trækker. (E) Hele opsætningen af mikroinjektionssystemet. Mikroskop (venstre), mikroinjektor og mikromanipulator (midten) og automatisk luftpumpe (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mutant screening . (A) Parring af mutanter og erhvervelse af homozygoter. B) PCR-produkter fra det mutante genom, som genererer et særskilt sæt toppe ved målet. (C) En af mutationstyperne og aminosyreændringerne. Sletningsmutationer fører til for tidlig afslutning af oversættelsen. Forkortelser: HE = heterozygoter, HO = homozygoter. Kontrol: embryo injiceret med krypterede sgRNA'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Injektion blanding | Injicerede embryoner | Klækkede larver | Pupper | Mosaik G0 | ||
| (Mosaik/voksne i alt) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Phenol rød (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Phenol rød (1 μL) | ||||||
Tabel 1: B. dorsalis overlevelse og mutagenese efter mikroinjektioner.
| Problem | Potentiel årsag(er) | Løsninger | |
| Ineffektiv embryonindsamling | 1. Voksne er i dårlig stand | 1.Sørg for, at der er mad og vand til rådighed, navnlig fødevarens sukkerindhold. | |
| 2. Utilstrækkelig parring | 2. Parring på forhånd under 30-50 Lux svage forhold. Det er bedst at vælge 12-15 dage gamle parrede voksne. | ||
| Dårlig lukkbarhed af æg efter injektion | 1. Embryoner af dårlig kvalitet | 1. Pluk friske og fyldige æg og børst dem forsigtigt med en vandvædet børste. | |
| 2. Nål passer ikke | 2. Spidsen af nålen er så lille som muligt for at minimere skader på ægget under injektionen. | ||
| 3. Forkert opdræt af æg efter injektion | 3. Æg skal holdes hydreret efter injektion for at forhindre dehydrering i at tørre ud. Æg kan også overføres direkte til mad efter injektion. | ||
| Lav larveoverlevelsesrate | 1. Moldy mad er ikke egnet til larvevækst | 1. For nyklækkede larver tilsættes en lille mængde mad. For meget mad vil forme eller tørre ud og påvirke larvernes vækst. | |
| 2. Nyklækkede larver gennemblødt i olie i lang tid | 2.De nyklækkede larver skal overføres til larveføden i tide, ellers skal æggene plukkes direkte i maden efter injektion. | ||
| Voksen mutationsrate er lav | 1. Lav kvalitet af gRNA | 1. Streng eksperimentel operation for at syntetisere gRNA af høj kvalitet for at forhindre nedbrydning. | |
| 2. Ineffektive mål fører til off-targets | 2. Screening af højeffektive mål igennem, som vores diskussion nævnte. | ||
Tabel 2: Mulige problemer med konstruktion af mutanter, potentielle årsager og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9-systemet er det mest anvendte genredigeringsværktøj og har forskellige anvendelser, såsom gen threpy30, afgrødeavl 31 og grundlæggende undersøgelser af genfuctions32. Dette system er allerede blevet anvendt til genredigering i forskellige insektarter og har fungeret som et effektivt værktøj til funktionelle genundersøgelser i skadedyr. De protokoller, vi præsenterer her, standardiserer proceduren for design og syntese af guide-RNA'er, indsamling af embryoner, embryoinjektion, insektopdræt og mutantscreening. Desuden blev der tilføjet en fejlfindingstabel for at opsummere det potentielle problem fra hvert trin, og deres løsninger blev leveret for at lette arbejdsbyrden og forbedre effektiviteten (tabel 2). Denne procedure giver en pålidelig måde at redigere gener af interesse og forbedrer de funktionelle genomiske undersøgelser i B. dorsalis.
For det første er målgenselektion afgørende for at øge effektiviteten af CRISPR/Cas9-systemet, og flere open source-softwareprogrammer som ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 og CRISPR optimal målfinder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) kan automatisk generere mål og forudsige potentielle off-target rater. Da den høje fecundity rate af B. dorsalis letter embryoindsamling, kan mutanthastigheder forudsiges ved at ofre en del af embryonerne til DNA-ekstraktion og sekventering af målområdet. Hvis sekventering ikke er tilgængelig i laboratoriet, anbefales det også at bruge T7 endonuklease I til at forudsige mutationshastigheder37. Målsteder med høje genomiske deletionsrater kan vælges gennem disse tre metoder, og derfor kan effektiviteten af genredigering i B. dorsalis øges.
Embryonets udviklingsstadium bestemmer, om mutationer vil blive arvet. For at opnå arvelige mutationer skal genredigering forekomme i kimceller. Generelt kan blandingen af sgRNA og Cas9 ikke leveres til kimceller, efter at polcelledannelse har fundet sted. I B. dorsalis fandt polcelledannelsen sted ved 3 timer efter æglægning 38, mens protokollen, der er beskrevet her for B. dorsalis, tager30 minutter fra embryoopsamling til slutningen af mikroinjektion. Under injektion dannes næsten ingen polceller i den vegetabilske ende af embryoet; derfor bør genmutationer opnået i G0 effektivt arves. Den tid, der forbruges ved mikroinjektion, er også mindre end den metode, der er nævnt i tidligere offentliggjorte papirer (generelt 1-3 timer)18,19.
Det er vigtigt at minimere mekaniske eller kemiske skader under processen med embryoindsamling og håndtering. Brug en fin børste til forsigtigt at stille embryoner op på injektionspladen. Injektionspositionen skal afspejle det arbejde, der tidligere er udført i Drosophila (Metoder - Nicolas Gompels laboratorium, http://gompel.org/methods) og Ceratitis capitata39. Injicer embryoner ved den vegetabilske pol; Indsæt aldrig nålen i dyrestangen. Forbered nålen efter mikropipettetrækkerguiden; Åbningen af nålen skal være så lille som muligt for at undgå overdreven cytoplasmatisk tilbagestrømning. Metoden nævnt i offentliggjorte undersøgelser i B. dorsalis dechorionerede generelt embryonerne med natriumhypochorit17,18,19; Dette kan forårsage kemisk skade og nedsætte embryonernes overlevelsesrate. I denne protokol dekorioneres embryoner ikke, og injektion fungerer stadig godt. Den kemiske skade på embryonerne kan være minimal.
Insektopdræt efter injektion er meget vigtig. Den standardiserede opdrætsprotokol, der er angivet her, kan tjene som reference for opdræt af andre bananfluearter, især Bactrocera-arter . Embryonerne kan nedsænkes i olie for at undgå udtørring under injektion ved hjælp af vores selvfremstillede injektionsplade. Minimer den tid, larven bruger i olien (<2 timer) for at opnå overlevelsesrater i G0 over 50%.
En ikke-invasiv metode til genomisk DNA-ekstraktion anbefales til mutant detektion. For eksempel foreslår nogle lepidopteranske forskere, at eksuviaterne af de endelige instarlarver kunne bruges til at ekstrahere genomisk DNA til yderligere genotypning. For B. dorsalis involverer en ikke-invasiv metode ekstraktion af genomisk DNA fra et frisk puparium. Injektion af flere sgRNA'er rettet mod et markørgen og genet af interesse kan også forbedre identifikationen af mutanter. For eksempel kan co-injicerede sgRNA'er rettet mod øjenfarve (kmo) og juvenil hormonreceptor (Met) producere 75% af afkom med dobbeltmutationer i myg. Mødte mutanter blev foreløbigt screenet baseret på øjenfarven på larver37. Dette bør evalueres i B. dorsalis i fremtiden for yderligere at forbedre effektiviteten af genredigering i denne insektart ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet.
Afslutningsvis er CRSIPR / Cas9-systemet et kraftfuldt værktøj i funktionel genomik i B. dorsalis. Vores detaljerede protokoller giver nyttige oplysninger til at hjælpe forskere med at opnå effektiv embryoindsamling, ideelle overlevelsesrater for larver og den ønskede redigeringseffektivitet. Dette kan være en enkel og hurtig måde at hjælpe forskere med at opnå mutagenese i B. dorsalis. Denne teknik kunne ikke anvendes i de funktionelle undersøgelser af dødelige gener, da de arvelige mutationer har brug for vellykkede krydsninger. Fremtidige undersøgelser kunne fokusere på at udvikle transgene værktøjer til at udtrykke scene- eller vævsspecifikke CRISPR-elementer for at bryde igennem denne begrænsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) og særlige midler til videnskabsteknologisk innovation og industriel udvikling af Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H.
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J.
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al.
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
