Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien mit einem modifizierten Protokoll vor, das für die Wismutsulfid (BS)-Fällung verwendet wird. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach zu bewerten ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.
Abstract
Schwefelwasserstoff (H2S) ist ein giftiges Gas, das von Bakterien bei der Proteolyse schwefelhaltiger Aminosäuren und Proteine produziert wird und eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielt. DerH2S-Produktionstestist einer der wichtigsten bakteriellen biochemischen Identifikationstests. Die traditionellen Methoden sind nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Hier haben wir eine einfache und sensitive Methode etabliert, umH2Sin Bakterien nachzuweisen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine modifizierte Version der Wismutsulfid (BS)-Fällung, bei der transparente 96-Well-Mikrotiterplatten verwendet werden. Die Bakterienkultur wurde mit einer L-Cysteinhaltigen Wismutlösung kombiniert und 20 min lang kultiviert, an deren Ende ein schwarzer Niederschlag beobachtet wurde. Die visuelle Nachweisgrenze für H 2 S lag bei0,2mM. Anhand des visuellen Farbwechsels kann eine einfache, durchsatzreiche und schnelle Detektion vonH2S-produzierendenBakterien erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dieser Methode dieH2S-Produktionin Bakterien nachgewiesen werden kann.
Introduction
Schwefelwasserstoff produzierende Bakterien können schwefelhaltige Aminosäuren und Proteine nutzen, um Schwefelwasserstoff (H2S) herzustellen. Die Produktion vonH2Serfolgt in der Regel in gramnegativen Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae sowie in Mitgliedern von Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. und Shewanella spp.1. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, Sulfat zu Schwefelwasserstoff (H2S) zu reduzieren, um Energie zu gewinnen. Schwefelwasserstoff wird mit der Entwicklung bakterieller Arzneimittelresistenzen in Verbindung gebracht. H2Sschützt Bakterien vor der Toxizität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und wirkt so der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika entgegen 2,3. H2Shat auch eine wichtige physiologische Wirkung bei der Aufrechterhaltung der Homöostase. Auf supraphysiologischer Ebene hat sichH2Sals hochgradig toxisch für den Körper erwiesen. Im menschlichen Körper hatH2Seine weitere Rolle als gasförmiges Signalmolekül, das an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. H2Skann die systolische Funktion des Herzens regulieren und spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Entspannung der Blutgefäße, der Hemmung des Gefäßumbaus und dem Schutz des Myokards 4,5. H2Sspielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Nervensystems und des Verdauungstraktes 6,7. Es wurde festgestellt, dass Bakterien, wenn sie bakteriziden Antibiotika ausgesetzt sind, tödliche reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren, die zum Zelltod führen 8,9,10,11.
Als gängiger biochemischer Test in mikrobiologischen Laborkursen ist der Schwefelwasserstofftest ein wichtiges Experiment zur Identifizierung von Bakterien, insbesondere Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. Derzeit wird der Schwefelwasserstofftest in der Regel an einer Vielzahl von schwefelhaltigen Aminosäuren und Bleiacetatmedium durchgeführt, die mit den zu testenden Bakterien beimpft sind. Nach einer Inkubationszeit (2-3 Tage) werden die Ergebnisse beurteilt, indem beobachtet wird, ob das Nährmedium oder der Bleiacetat-Papierstreifen aufgrund der Bleiacetatproduktion geschwärzt ist11. Diese traditionellen Methoden sind jedoch nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Für den Nachweis von H2S12,13 wurde ein Wismut-basiertes Verfahren etabliert. H2Skann mit Wismut reagieren und schwarze Wismutsulfidausfällung bilden. Um eine Reform für diesen biochemischen Test durchzuführen, muss eine einfache und schnelle Methode ohne Nebenwirkungen auf das Bakterienwachstum etabliert werden. Hier haben wir eine einfache Methode zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien entwickelt, die in einer in vitro Umgebung unter Verwendung von Wismutsulfid als Substrat in einem 96-Well-Mikrotiterplattenformat gezüchtet wurden.
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Protocol
1. Bakterienstämme
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden neun Standardstämme verwendet, darunter Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris und Klebsiella pneumoniae (Tabelle 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa und Proteus vuigaris könnenH2Sproduzieren, wie in der bisherigen Literaturbeschrieben 1.
- Vorbereitung der Bakterienkultur
- Übertragen Sie eine Bakterienkolonie von Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 und Klebsiella pneumoniae von einer Luria-Bertani (LB)-Agarplatte auf 100 ml LB-Medium und Kultur bei 37 °C für 12-16 h, bis die Bakterienkonzentration etwa 1 x 109 Zellen/ml beträgt (wie durch OD600 = 1 angegeben).
- Übertragen Sie eine Bakterienkolonie von Fusobacterium nucleatum und Proteus vuigaris von Trypticase-Sojabrühe-Agarplatten (TSB) auf 100 ml TSB-Medium und kultivieren Sie sie bei 37 °C anaerob für 24 h, bis die Bakterienkonzentration etwa 1 x 109 Zellen/ml beträgt (wie durch OD600 = 1 angegeben).
2. H2S-Detektionsassay
- Test zur Herstellung von Schwefelwasserstoff
- Mischen Sie 100 μl Bakterienkultur mit 100 μl neu hergestellter Wismutlösung (pH 8,0; 10 mM Wismut(III)-chlorid, 0,4 M Triethanolamin-HCl, 20 mM Pyridoxal-5-Phosphat-Monohydrat, 20 mM EDTA und 40 mM L-Cystein) in den 96-Well-Mikrotiterplatten und kultivieren Sie sie 20 min lang bei 37 °C. Führen Sie für jeden Bakterienstamm die Analyse in dreifacher Ausfertigung durch.
- Prüfen Sie nach 20 Minuten, ob sich die Farbe verändert hat. Ändert sich die Farbe der Lösung von hellgelb nach schwarz, deutet dies darauf hin, dass das Bakterium in der Lage ist,H2Szu produzieren. Wiederholen Sie diese Messung 3x.
- Sensitivität der Methode
- Bestimmen Sie die Sensitivität der Methode unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Natriumhydrosulfid (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0 mM, gemischt mit BS-Lösung 14.
- Bestimmen Sie das Vorhandensein von HS−/S2− durch Beobachtung der Bildung eines schwarzen BS-Niederschlags. Bewerten Sie die Farbe der Vertiefungen mit einer visuellen Skala von keiner Farberzeugung (-) bis zur dunkelsten schwarzen Farberzeugung (++++++).
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Representative Results
Nachweis von Schwefelwasserstoff-produzierenden Bakterien
Die Leistungsfähigkeit desH2S-Testswurde anhand von Reinkulturen ausgewählter Bakterienstämme untersucht, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Proteus vuigaris H2Smit schwarzem BS-Niederschlag produzieren können, während Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila und Klebsiella pneumoniae keinen schwarzen Niederschlag zeigten. Die schnellsteH2S-Produktionwurde für Fusobacterium nucleatum beobachtet, wobei die maximale Farbproduktion erreicht wurde (Abbildung 1).
Sensitivität der Methode
Die Sensitivität wurde durch Mischen verschiedener Konzentrationen von Natriumhydrosulfid (NaHS) mit BS-Lösung bestimmt. Die visuelle Inspektion zeigte, dass sich die Farbtiefe der Lösung mit zunehmender Ionenkonzentration von HS−/S 2− vertiefte (Abbildung 2). Die Nachweisgrenze vonH2Sfür die Methode liegt bei 0,2 mM.
Abbildung 1: Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien. Die Produktion vonH2Sin Fusobacterium nucleatum wurde durch die Bildung des schwarzen BS-Niederschlags nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Sensitivität der Wismutsulfid (BS)-Methode. Die Sensitivität der BS-Methode zur Detektion vonH2Swurde mit keiner Farbproduktion (-) gegenüber dunkelster schwarzer Farbproduktion (+++++) aufgezeichnet. Von links nach rechts betragen die NaHS-Konzentrationen 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0 mM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Spezies | H2S Produktion a | |
| Salmonella paratyphi Ein | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabelle 1: Visuelle Beurteilung derH2S-Produktion. Die Produktion von Schwefelwasserstoff (H2S) durch verschiedene Bakterienstämme wurde mit der visuellen Methode in einer 96-Well-Mikrotiterplatte gemessen. a: Aufgezeichnet als Ausfällung von schwarzem Wismutsulfid (BS) von keiner Farbproduktion (-) zu schwarzer Farbproduktion (+).
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Discussion
Der Schwefelwasserstoffproduktionstest ist einer der konventionellen phänotypischen Tests zur Identifizierung und Differenzierung von Bakterienstämmen. Viele Bakterienarten können in ihrer natürlichen Umgebung, wie z. B. Wasser, Schwefelwasserstoff produzieren. Zu diesen Bakterienarten gehören Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., einige Stämme von Klebsiella sp., Escherichia coli und einige Arten von anaeroben Clostridien15,16. Die Sensitivität der herkömmlichenH2S-Prüfmethodeist jedoch gering und die Methode ist zeitaufwändig17,18. Das herkömmlicheH2S-Testmediumenthält PbAc, das toxische Auswirkungen auf das Wachstum von Bakterien hat, und die Kultur wird punktionsinokuliert in halbfestes Agar. Der Sauerstoffgehalt im unteren Teil des Mediums ist gering, so dass die aeroben Bakterien schlecht wachsen. Daher führt es oft zu falsch-negativen Ergebnissen.
Bei dieser Methode haben wir Wismut (III) anstelle von Blei oder Eisenionen verwendet. Wenn ein Bakterienisolat, dasH2Sproduziert, Wismut(III)-chlorid ausgesetzt wird, findet eine Substitutionsreaktion statt. Bei dieser Reaktion tauschen sich das Chloridion und das Sulfid-Ion aus, wobei Chlorwasserstoff und Wismut(III)-sulfid entstehen; Dieses Wismut(III)-sulfidprodukt fällt als schwarzer Feststoff aus der Lösung aus. Die Farbtiefe des schwarzen Niederschlags kann bis zu einem gewissen Grad verwendet werden, um die Menge anH2Szu bestimmen, die durch den Bakterienstamm produziert wird. Basierend auf der BS-Fällung und der hohen Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Einfachheit wurde die in der Studie gezeigte Methode als Schwefelwasserstofftest zum Nachweis vonH2S-produzierendenBakterien etabliert. Der entscheidende Schritt bei dieser Methode ist, dass die Wismutlösung frisch zubereitet wird. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode gibt es keine Schwermetallsalztoxizität beim Wachstum von Bakterien, und es kann auch Zeit für den Nachweis von schwefelwasserstoffproduzierenden aeroben Bakterien sparen.
In dieser Arbeit wird basierend auf der Reaktion von Wismut(III)-chlorid und H2S, die Visualblack-BS-Fällung erzeugte, eine einfache, empfindliche, kostengünstige und Hochdurchsatzmethode zum Nachweis vonH2S-produzierendenBakterien gezeigt. Diese Methode eignet sich für die schnelle Detektion kontaminierter Proben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch das Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) und das Teaching Reform Research Project der China Pharmaceutical University (2019XJYB18) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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