Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage hydrogensulfidproduserende bakterier med en modifisert protokoll som brukes til utfelling av vismutsulfid (BS). De viktigste fordelene med denne metoden er at den er enkel å evaluere og ikke krever spesialutstyr.
Abstract
Hydrogensulfid (H2S) er en giftig gass produsert av bakterier i proteolyse av svovelholdige aminosyrer og proteiner som spiller en viktig rolle i menneskers helse. H2S produksjonstest er en av de viktige bakterielle biokjemiske identifikasjonstestene. De tradisjonelle metodene er ikke bare kjedelige og tidkrevende, men også utsatt for inhibering av bakterievekst på grunn av den toksiske effekten av tungmetallsalter i svovelholdig medium, noe som ofte fører til negative resultater. Her etablerte vi en enkel og sensitiv metode for å påvise H2S i bakterier. Denne metoden er en modifisert versjon av vismutsulfid (BS) nedbør som bruker 96-brønns gjennomsiktige mikrotiterplater. Bakteriekultur ble kombinert med vismutoppløsning inneholdende L-cystein og dyrket i 20 minutter, på slutten av hvilket et svart bunnfall ble observert. Synsdeteksjonsgrensen for H 2 S var0,2mM. Basert på den visuelle fargeendringen kan den enkle, høye gjennomstrømningen og raske påvisningen av H2S-produserende bakterier oppnås. Oppsummert kan denne metoden brukes til å identifisereH2S-produksjoni bakterier.
Introduction
Hydrogensulfidproduserende bakterier kan utnytte svovelholdige aminosyrer og proteiner for å produsere hydrogensulfid (H2S). Produksjonen av H2S forekommer vanligvis i gram-negative Enterobacteriaceae-familiebakterier og også hos medlemmer av Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. og Shewanella spp.1. Disse bakteriene har evnen til å redusere sulfat til hydrogensulfid (H2S) for å oppnå energi. Hydrogensulfid har vært involvert i utviklingen av bakteriell stoffresistens. H 2 S beskytter bakterier mot toksisitet av reaktive oksygenarter (ROS), og motvirker dermed den antibakterielle effekten av antibiotika 2,3. H2S har også en viktig fysiologisk effekt ved å opprettholde homeostase. På suprafysiologiske nivåer har H2S vist seg å være dypt giftig for kroppen. I menneskekroppen har H2S en annen rolle som et gasssignalmolekyl som er involvert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. H2S kan regulere hjertets systoliske funksjon og spiller en viktig fysiologisk rolle i å slappe av blodkar, hemme vaskulær remodellering og beskytte myokardiet 4,5. H2S spiller også en viktig rolle i regulering av nervesystemet og fordøyelseskanalen 6,7. Det har blitt funnet at når de blir utsatt for bakteriedrepende antibiotika, produserer bakterier dødelige reaktive oksygenarter (ROS) som fører til celledød 8,9,10,11.
Som en vanlig biokjemisk test i mikrobiologiske laboratoriekurs er hydrogensulfidtesten et viktig eksperiment i identifisering av bakterier, spesielt bakterier i familien Enterobacteriaceae. For tiden utføres hydrogensulfidtesten vanligvis på et stort antall svovelholdige aminosyrer og blyacetatmedium inokulert med bakteriene som skal testes. Etter en periode med inkubasjon (2-3 dager) bedømmes resultatene ved å observere om kulturmediet eller blyacetatpapirstrimmelen er svertet på grunn av blyacetatproduksjon11. Imidlertid er disse tradisjonelle metodene ikke bare kjedelige og tidkrevende, men også utsatt for inhibering av bakterievekst på grunn av den toksiske effekten av tungmetallsalter i svovelholdig medium, noe som ofte fører til negative resultater. Det er etablert en vismutbasert metode for påvisning av H2S12,13. H2S kan reagere med vismut og danne svart vismutsulfidutfall. For å gjennomføre en reform for denne biokjemiske testen, må en enkel og rask metode uten bivirkninger på bakterievekst etableres. Her satte vi opp en enkel metode for påvisning av hydrogensulfidproduserende bakterier dyrket i et in vitro-miljø ved bruk av vismutsulfid som substrat i et 96-brønns mikrotiterplateformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterielle stammer
MERK: For dette eksperimentet ble ni standardstammer brukt, inkludert Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris og Klebsiella pneumoniae (tabell 1). Salmonella paratyfi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa og Proteus vuigaris kan produsere H2S, som skissert i tidligere litteratur1.
- Fremstilling av bakteriekultur
- Overfør en bakteriekoloni av Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 og Klebsiella pneumoniae fra en Luria-Bertani (LB) agarplate til 100 ml LB medium og kultur ved 37 °C i 12-16 timer til bakteriekonsentrasjonen er ca. 1 x 109 celler/ml (som indikert ved OD600 = 1).
- Overfør en bakteriekoloni av Fusobacterium nucleatum og Proteus vuigaris fra trypticase soyabuljong (TSB) agarplater til 100 ml TSB medium og kultur ved 37 °C anaerobt i 24 timer til bakteriekonsentrasjonen er ca. 1 x 109 celler/ml (som indikert ved OD600 = 1).
2. H2S deteksjonsanalyse
- Produksjonstest for hydrogensulfid
- Bland 100 μL bakteriekultur med 100 μL nyfremstilt vismutoppløsning (pH 8,0; 10 mM vismut (III) klorid, 0,4 M trietanolamin-HCl, 20 mM pyridoksal 5-fosfatmonohydrat, 20 mM EDTA og 40 mM L-cystein) i 96-brønns mikrotiterplater og kultur i 20 minutter ved 37 °C. For hver bakteriestamme, utfør analysen i tre eksemplarer.
- Etter 20 min, sjekk for fargeendring. Hvis fargen på løsningen endres fra lysegul til svart, indikerer dette at bakteriene er i stand til å produsere H2S. Gjenta denne målingen 3x.
- Sensitivitet av metoden
- Bestem metodens sensitivitet ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av natriumhydrosulfid (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0 mM, blandet med BS-oppløsning 14.
- Bestem tilstedeværelsen av HS-/S2− ved å observere dannelsen av et svart BS-bunnfall. Skår fargen på brønnene ved hjelp av en visuell skala fra ingen fargeproduksjon (-) til mørkeste svartfargeproduksjon (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Påvisning av hydrogensulfidproduserende bakterier
Utførelsen av H2S-testen ble undersøkt ved hjelp av rene kulturer av utvalgte bakteriestammer, som vist i tabell 1. Resultatene indikerte at Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa og Proteus vuigaris kan produsere H2S med svart BS-bunnfall, mens Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila og Klebsiella pneumoniae ikke viste noe svart bunnfall. Den raskesteH2S-produksjonenble sett for Fusobacterium nucleatum, og nådde maksimal fargeproduksjon (figur 1).
Sensitivitet av metoden
Sensitiviteten ble bestemt ved å blande forskjellige konsentrasjoner av natriumhydrosulfid (NaHS) med BS-oppløsning. Visuell inspeksjon viste at fargedybden til løsningen ble forsterket med en økende ionekonsentrasjon av HS-/S 2− (figur 2). Deteksjonsgrensen for H 2 S for metoden er 0,2mM.
Figur 1: Påvisning av hydrogensulfidproduserende bakterier. Produksjonen av H2S i Fusobacterium nucleatum ble detektert av den svarte BS-utfellingsdannelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sensitivitet av vismutsulfidmetoden (BS). Sensitiviteten til BS-metoden for påvisning av H2S ble registrert som ingen fargeproduksjon (-) til mørkeste svartfargeproduksjon (+++++). Fra venstre til høyre er NaHS-konsentrasjonene 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0 mM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Art | H2S produksjon a | |
| Salmonella paratyfi En | _ | |
| Salmonella paratyfi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabell 1: Visuell vurdering av H2S produksjon. Produksjonen av hydrogensulfid (H2S) av forskjellige bakteriestammer ble målt ved hjelp av den visuelle metoden i en 96-brønns mikrotiterplate. a: Registrert som svart vismutsulfid (BS) nedbør fra ingen fargeproduksjon (-) til svart fargeproduksjon (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produksjonstesten for hydrogensulfid er en av de konvensjonelle fenotypiske testene for identifisering og differensiering av bakteriestammer. Mange bakteriearter kan produsere hydrogensulfid i sitt naturlige miljø, for eksempel vannvann. Disse bakterieartene inkluderer Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., noen stammer av Klebsiella sp., Escherichia coli og noen arter av anaerob Clostridia15,16. Sensitiviteten til den tradisjonelle H2S testmetoden er imidlertid lav, og metoden er tidkrevende17,18. Det tradisjonelle H2S testmediet inneholder PbAc, som har toksiske effekter på veksten av bakterier, og kulturen er punkteringsinokulert i halvfast agar. Oksygeninnholdet i den nedre delen av mediet er lavt, slik at de aerobe bakteriene vokser dårlig. Derfor fører det ofte til falske negative resultater.
I denne metoden brukte vi vismut (III) i stedet for bly eller jernholdige ioner. Når et bakterieisolat som produserer H2S eksponeres for vismut (III) klorid, finner en substitusjonsreaksjon sted. I denne reaksjonen bytter kloridion- og sulfidionposisjonene, som produserer hydrogenklorsyre og vismut (III) sulfid; dette vismut (III) sulfidproduktet faller ut av løsningen som et svart fast stoff. Fargedybden til det svarte bunnfallet kan til en viss grad brukes til å bestemme mengden H2S produsert av bakteriestammen. Basert på BS-nedbør og høy reproduserbarhet, pålitelighet og enkelhet, ble metoden vist i studien etablert som en hydrogensulfidtest for påvisning av H2S-produserende bakterier . Det kritiske trinnet i denne metoden er at vismutløsningen skal tilberedes frisk. Sammenlignet med den tradisjonelle metoden er det ingen tungmetallsalttoksisitet i veksten av bakterier, og det kan også spare tid for påvisning av hydrogensulfidproduserende aerobe bakterier.
I denne artikkelen, basert på reaksjonen av vismut (III) klorid og H 2 S,som produserte visuellsvart BS-utfelling, vises en enkel, følsom, billig og høy gjennomstrømningsmetode for påvisning av H2S produserende bakterier. Denne metoden er nyttig for rask påvisning av forurensede prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) og Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
