Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno con un protocolo modificado utilizado para la precipitación de sulfuro de bismuto (BS). Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y no requiere equipo especializado.
Abstract
El sulfuro de hidrógeno (H2S) es un gas tóxico producido por bacterias en la proteólisis de aminoácidos y proteínas que contienen azufre que desempeña un papel importante en la salud humana. La prueba de producción deH2Ses una de las pruebas de identificación bioquímica bacteriana importantes. Los métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Aquí, establecimos un método simple y sensible para detectarH2Sen bacterias. Este método es una versión modificada de la precipitación de sulfuro de bismuto (BS) que utiliza placas de microtitulación transparentes de 96 pocillos. El cultivo bacteriano se combinó con una solución de bismuto que contenía L-cisteína y se cultivó durante 20 min, al final de los cuales se observó un precipitado negro. El límite de detección visual paraH2Sfue de 0,2 mM. Sobre la base del cambio de color visual, se puede lograr la detección simple, de alto rendimiento y rápida de las bacterias productoras deH2S. En resumen, este método se puede utilizar para identificar la producción deH2Sen bacterias.
Introduction
Las bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno pueden utilizar aminoácidos y proteínas que contienen azufre para producir sulfuro de hidrógeno (H2S). La producción deH2Socurre generalmente en bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae y también en miembros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. y Shewanella spp.1. Estas bacterias tienen la capacidad de reducir el sulfato en sulfuro de hidrógeno (H2S) para obtener energía. El sulfuro de hidrógeno ha sido implicado en el desarrollo de resistencia bacteriana a los medicamentos. H2Sprotege a las bacterias de la toxicidad de las especies reactivas de oxígeno (ROS), antagonizando así el efecto antibacteriano de los antibióticos 2,3. H2Stambién tiene un efecto fisiológico importante en el mantenimiento de la homeostasis. A niveles suprafisiológicos, se ha demostrado que elH2Ses profundamente tóxico para el cuerpo. En el cuerpo humano,H2Stiene otro papel como molécula de señalización de gas que está involucrada en una variedad de procesos fisiológicos y patológicos. H2Spuede regular la función sistólica del corazón y desempeña un papel fisiológico importante en la relajación de los vasos sanguíneos, la inhibición de la remodelación vascular y la protección del miocardio 4,5. ElH2Stambién juega un papel importante en la regulación del sistema nervioso y del tracto digestivo 6,7. Se ha encontrado que, cuando se exponen a antibióticos bactericidas, las bacterias producen especies letales reactivas de oxígeno (ROS) que conducen a la muerte celular 8,9,10,11.
Como una prueba bioquímica común en cursos de laboratorio microbiológico, la prueba de sulfuro de hidrógeno es un experimento importante en la identificación de bacterias, especialmente bacterias de la familia Enterobacteriaceae. En la actualidad, la prueba de sulfuro de hidrógeno generalmente se realiza en una gran cantidad de aminoácidos que contienen azufre y medio de acetato de plomo inoculados con las bacterias a probar. Después de un período de incubación (2-3 días), los resultados se juzgan observando si el medio de cultivo o la tira de papel de acetato de plomo se ennegrece debido a la producción de acetato de plomo11. Sin embargo, estos métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Se ha establecido un método basado en bismuto para la detección de H2S12,13. H2Spuede reaccionar con el bismuto, formando precipitación de sulfuro de bismuto negro. Para llevar a cabo una reforma para esta prueba bioquímica, se debe establecer un método simple y rápido sin efectos secundarios sobre el crecimiento bacteriano. Aquí, establecimos un método simple para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno cultivadas en un ambiente in vitro utilizando sulfuro de bismuto como sustrato en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos.
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Protocol
1. Cepas bacterianas
NOTA: Para este experimento, se utilizaron nueve cepas estándar, incluyendo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigis y Klebsiella pneumoniae (Tabla 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producirH2S, como se describe en la literatura previa1.
- Preparación de cultivo bacteriano
- Transferir una colonia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 y Klebsiella pneumoniae de una placa de agar Luria-Bertani (LB) a 100 ml de medio LB y cultivar a 37 °C durante 12-16 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 109 células/ml (como lo indica el OD600 = 1).
- Transfiera una colonia bacteriana de Fusobacterium nucleatum y Proteus vuigaris de las placas de agar caldo de soja tripticasa (TSB) a 100 ml de medio TSB y cultive anaeróbicamente a 37 °C durante 24 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 109 células/ml (como lo indica el OD600 = 1).
2. Ensayo de detección deH2S
- Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno
- Mezclar 100 μL de cultivo bacteriano con 100 μL de solución de bismuto recién preparada (pH 8,0; cloruro de bismuto (III) de 10 mM, trietanolamina-HCl 0,4 M, piridoxal 5-fosfato monohidrato de 20 mM, EDTA de 20 mM y L-cisteína de 40 mM) en las placas de microtitulación de 96 pocillos y cultivar durante 20 min a 37 °C. Para cada cepa bacteriana, realizar el análisis por triplicado.
- Después de 20 minutos, compruebe si hay cambio de color. Si el color de la solución cambia de amarillo claro a negro, esto indica que la bacteria es capaz de producirH2S. Repita esta medición 3x.
- Sensibilidad del método
- Determinar la sensibilidad del método utilizando diferentes concentraciones de hidrosulfuro de sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM y 0 mM, mezclado con solución BS 14.
- Determinar la presencia de HS−/S2− observando la formación de un precipitado negro de BS. Puntúe el color de los pozos utilizando una escala visual desde ninguna producción de color (-) hasta la producción de color negro más oscuro (++++++).
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Representative Results
Detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno
La realización de la pruebaH2Sse investigó utilizando cultivos puros de cepas bacterianas seleccionadas, como se indica en la Tabla 1. Los resultados indicaron que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producirH2Scon precipitado negro de BS, mientras que Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila y Klebsiella pneumoniae no mostraron ningún precipitado negro. La producción más rápida deH2Sse observó para Fusobacterium nucleatum, alcanzando la máxima producción de color (Figura 1).
Sensibilidad del método
La sensibilidad se determinó mezclando diferentes concentraciones de hidrosulfuro de sodio (NaHS) con solución de BS. La inspección visual reveló que la profundidad de color de la solución se profundizó con una concentración de iones creciente de HS−/S 2− (Figura 2). El límite de detección deH2Spara el método es de 0,2 mM.
Figura 1: Detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno. La producción deH2Sen Fusobacterium nucleatum fue detectada por la formación de precipitado negro BS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sensibilidad del método de sulfuro de bismuto (BS). La sensibilidad del método BS para la detección deH2Sse registró como ninguna producción de color (-) a la producción de color negro más oscuro (+++++). De izquierda a derecha, las concentraciones de NaHS son 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM y 0 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especie | H2S producción a | |
| Salmonella paratyphi Un | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabla 1: Evaluación visual de la producción deH2S. La producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) por diferentes cepas bacterianas se midió utilizando el método visual en una placa de microtitulación de 96 pocillos. a: Registrado como precipitación de sulfuro de bismuto negro (BS) desde ninguna producción de color (-) hasta la producción de color negro (+).
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Discussion
La prueba de producción de sulfuro de hidrógeno es una de las pruebas fenotípicas convencionales para la identificación y diferenciación de cepas bacterianas. Muchas especies bacterianas pueden producir sulfuro de hidrógeno en su entorno natural, como el agua acuática. Estas especies bacterianas incluyen Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algunas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli, y algunas especies de Clostridia15,16 anaerobios. Sin embargo, la sensibilidad del método de prueba tradicional deH2Ses baja, y el método consumemucho tiempo 17,18. El medio de prueba tradicional deH2Scontiene PbAc, que tiene efectos tóxicos sobre el crecimiento de bacterias, y el cultivo se inocula por punción en agar semisólido. El contenido de oxígeno en la parte inferior del medio es bajo, por lo que las bacterias aeróbicas crecen mal. Por lo tanto, a menudo conduce a resultados falsos negativos.
En este método, utilizamos bismuto (III) en lugar de plomo o iones ferrosos. Cuando un aislado bacteriano que produceH2Sse expone al cloruro de bismuto (III), se produce una reacción de sustitución. En esta reacción, las posiciones de intercambio iónico cloruro y sulfuro, produciendo ácido clorhídrico y sulfuro de bismuto (III); este producto de sulfuro de bismuto (III) precipita fuera de la solución como un sólido negro. La profundidad de color del precipitado negro se puede utilizar hasta cierto punto para determinar la cantidad deH2Sproducida por la cepa bacteriana. Basado en la precipitación de BS y la alta reproducibilidad, confiabilidad y simplicidad, el método mostrado en el estudio se estableció como una prueba de sulfuro de hidrógeno para la detección de bacterias productoras deH2S. El paso crítico de este método es que la solución de bismuto debe prepararse fresca. En comparación con el método tradicional, no hay toxicidad por sales de metales pesados en el crecimiento de bacterias, y también puede ahorrar tiempo para la detección de bacterias aeróbicas productoras de sulfuro de hidrógeno.
En este artículo, basado en la reacción del cloruro de bismuto (III) y H2S, que produjo precipitación visual de BS negro, se muestra un método simple, sensible, económico y de alto rendimiento para la detección de bacterias productoras deH2S. Este método es útil para la detección rápida de muestras contaminadas.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y el Proyecto de Investigación de Reforma Docente de la Universidad Farmacéutica de China (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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