Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Face تحضير وسادة الشغاف لتحليل التشكل المستوي في أجنة الفئران

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

كلاسيكيا ، تم تحليل الشغاف من بدائية الصمام الجنيني للفأر باستخدام أقسام مستعرضة أو إكليلية أو سهمية. يسمح نهجنا الجديد للوجه والتصوير ثنائي الأبعاد للشغاف في المناطق الصمامية بالقطبية المستوية وتحليل إعادة ترتيب الخلايا للشغاف أثناء تطوير الصمام.

Abstract

تعد دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطور قلب الثدييات أمرا ضروريا لمعالجة أمراض القلب الخلقية البشرية. يتضمن تطوير صمامات القلب البدائية الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) لخلايا الشغاف من القناة الأذينية البطينية (AVC) ومناطق تدفق القلب (OFT) استجابة لإشارات عضلة القلب والشغاف الاستقرائية المحلية. بمجرد أن تنفصل الخلايا وتغزو المصفوفة خارج الخلية (هلام القلب) الموجودة بين الشغاف وعضلة القلب ، تتشكل وسائد الشغاف البدائية (EC). تشير هذه العملية إلى أن الشغاف يجب أن يملأ الفجوات التي خلفتها الخلايا غير المبطنة ويجب أن يعيد تنظيم نفسه للتقارب (الضيق) أو التمدد (الإطالة) على طول المحور. وقد تورط البحث الحالي مسار قطبية الخلية المستوية (PCP) في تنظيم التوطين تحت الخلوي للعوامل المشاركة في هذه العملية. كلاسيكيا، تمت دراسة المراحل الأولية لتطور صمام القلب في المقاطع العرضية للقلوب الجنينية أو في النباتات خارج الجسم الحي AVC أو OFT المستزرعة على جل الكولاجين. تسمح هذه الأساليب بتحليل القطبية القاعدية ولكنها لا تسمح بتحليل سلوك الخلية داخل مستوى الظهارة أو التغيرات المورفولوجية للخلايا المهاجرة. هنا ، نعرض نهجا تجريبيا يسمح بتصور الشغاف في المناطق الصمامية كحقل مستو للخلايا. يوفر هذا النهج التجريبي الفرصة لدراسة PCP ، والطوبولوجيا المستوية ، والاتصال بين الخلايا داخل الشغاف في OFT و AVC أثناء تطوير الصمام. قد يساهم فك رموز الآليات الخلوية الجديدة المشاركة في تكوين صمام القلب في فهم أمراض القلب الخلقية المرتبطة بعيوب وسادة الشغاف.

Introduction

القلب هو أول عضو وظيفي لجنين الثدييات. حول اليوم الجنيني (E) 7.5 في الفئران ، تشكل خلايا الأديم المتوسط قبل القلب الثنائية الهلال القلبي في الجانب البطني1. يحتوي الهلال القلبي على مجموعتين من الخلايا قبل القلبية التي تشمل أسلاف عضلة القلب والشغاف2. حوالي E8.0 ، تندمج السلائف القلبية في خط الوسط ، وتشكل أنبوب القلب البدائي الذي يتكون من نسيجين ظهاريين ، عضلة القلب الخارجية ، والشغاف الداخلي ، وهو بطانة متخصصة مفصولة بمصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. في وقت لاحق ، في E8.5 ، يخضع أنبوب القلب لحلقات يمنية. يحتوي القلب الحلقي على مناطق تشريحية مختلفة ذات توقيعات جزيئية محددة مثل قناة التدفق (OFT) والبطينين والقناة الأذينية البطينية (AVC)3. على الرغم من أن أنبوب القلب يتوسع في البداية في جانب التدفق من خلال إضافة الخلايا4 ، عند E9.5 ، يؤدي الانتشار القلبي المكثف إلى تضخم الغرف وإنشاء الشبكة التربيقية5. يحدث تكوين الصمام في AVC (الصمامات التاجية وثلاثية الشرف المستقبلية) وفي OFT (الصمامات الأبهرية والرئوية المستقبلية).

يلعب الشغاف أدوارا حاسمة في تطوير الصمام. تخضع خلايا الشغاف للانتقال الظهاري الوسيط (EMT) في AVC و OFT لتشكيل وسائد الشغاف ، وهي بنية تظهر في بداية تطور الصمام. تعمل مسارات الإشارات المختلفة على تنشيط هذه العملية ؛ في E9.5 في الفئران ، يعزز NOTCH المنشط في الشغاف استجابة ل BMP2 المشتق من عضلة القلب EMT الغازية لخلايا الشغاف في مناطق AVC و OFT من خلال تنشيط TGFβ2 و SNAIL (SNAI1) ، الذي يقمع مباشرة التعبير عن الكاديرين البطاني الوعائي (VE-cadherin) ، وهو مكون عبر الغشاء من تقاطعات الملتصقة (AJs) 6،7،8 . في OFT ، يتم تنشيط الشغاف لبدء EMT بواسطة FGF8 و BMP4 ، الذي يتم تنشيط تعبيره بواسطة NOTCH9،10،11،12.

يتضمن تقدم EMT ديناميكيات خلوية حيث تغير الخلايا شكلها ، وتكسر وتعيد تشكيل التقاطعات مع جيرانها ، وتتحلل ، وتبدأ في الهجرة13. تشمل هذه التغييرات إعادة تشكيل AJ والتفكيك التدريجي 14,15 ، وإشارات قطبية الخلية المستوية (PCP) ، وفقدان القطبية القاعدية (ABP) ، والانقباض القمي ، والتنظيم الهيكلي الخلوي 16,17. يشير ABP إلى توزيع البروتينات على طول المحور الأمامي الخلفي للخلية. في القلب النامي ، مطلوب تنظيم ABP في خلايا عضلة القلب لتطوير البطين18. يشير PCP إلى التوزيع المستقطب للبروتينات داخل الخلايا عبر مستوى الأنسجة وينظم التوزيع الخلوي. تتكون الظهارة ذات الهندسة المستقرة من خلايا سداسية الشكل ، حيث تتلاقى ثلاث خلايا فقط عند الرؤوس19،20،21،22. تنتج العمليات الخلوية المختلفة ، مثل انقسام الخلايا أو تبادل الجيران أو التفريغ الذي يحدث أثناء التشكل الطلائي ، زيادة في عدد الخلايا التي تتقارب على قمة وعدد الخلايا المجاورة التي تحتوي عليها خلية معينة22. يمكن تنظيم هذه السلوكيات الخلوية المتعلقة ب PCP من خلال مسارات إشارات مختلفة أو ديناميكيات الأكتين أو الاتجار داخل الخلايا23.

تم الحصول على البيانات الناتجة عن دراسة تطور الصمام في الفئران من المقاطع المستعرضة أو الإكليلية أو السهمية للقلوب الجنينية E8.5 و E9.5 ، حيث يظهر الشغاف كخط من الخلايا بدلا من كونه مجالا من الخلايا - يغطي الشغاف السطح الداخلي بالكامل لأنبوب القلب24. لا تسمح الأقسام الجنينية بتحليل PCP في شغاف أجنة الفئران. تسمح طريقتنا التجريبية الجديدة بتحليل توزيع خلايا الشغاف ، وتباين الخواص AJ ، وتحليل شكل الخلية الواحدة ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. هذا النوع من البيانات مطلوب لتحليل PCP ، جنبا إلى جنب مع وصف الجزيئات الأخرى المتعلقة ب PCP ، غير الموضحة في هذا التقرير. يتيح التألق المناعي الكامل ، وإعداد العينات المحددة واستخدام الفئران المعدلة وراثيا تحليل القطبية المستوية في الشغاف في بداية تطور الصمام في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة للمركز الوطني للبحوث القلبية الوعائية (CNIC) ومجتمع مدريد (المرجع PROEX 155.7/20). تتوافق جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوان مع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC فيما يتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى ، والتي تم سنها في القانون الإسباني بموجب Real Decreto 1201/2005.

1. Obtention of AVC و / أو OFTs (مقتبس من Xiao et al. 25)

  1. قم بإعداد الصلبان في فترة ما بعد الظهر بين أنثى mTmG والذكور VE-Cadherin-Cre-ERT / +.
  2. في صباح اليوم التالي ، تحقق من وجود سدادة مهبلية. إذا كان هناك سدادة مهبلية ، احسبها نصف يوم (E0.5). اعتمادا على تجربة الاهتمام ، عد 8 أيام أو 9 أيام.
  3. قبل 24 ساعة من التشريح ، قم بإعطاء الأنثى الحامل عن طريق الفم ب 50 ميكرولتر من 5 ملغ / مل 4-OH-Tamoxifen المخفف في زيت الذرة.
    ملاحظة: ستحفز هذه الجرعة كمية محدودة من إعادة التركيب بوساطة CRE التي كشف عنها وجود استنساخ إيجابي ل GFP. يجب تحديد الجرعة المناسبة مع كل دفعة جديدة من 4-OH-Tamoxifen.
  4. التضحية بالأنثى الحامل في E8.5 أو E9.5 عن طريق خلع عنق الرحم.
  5. فتح بطن الفئران الحامل باستخدام المقص وإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة باستخدام المقص والملقط الناعم.
  6. ضع الرحم في طبق بتري يحتوي على محلول ملحي بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS) مع 0.1٪ Tween-20 (PBT).
  7. إزالة deciduae الفرد من الرحم تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط غرامة.
  8. باستخدام ملاقط دقيقة ، قم بعمل شق في الجزء الأبيض من النفضي ، حيث يوجد الجنين ، وقم بإزالته برفق ، وتجنب السحب ، ونقل الأجنة إلى طبق بتري جديد مع PBT طازج باستخدام P1000 مع قطع الطرف ، وترك قطرا كبيرا بما يكفي لمرور الجنين دون كسر.
  9. من أجل التنميط الجيني ، خذ قطعة صغيرة من كيس الصفار (0.5 مم2) أو قطعة من الذيل (من الطرف الخلفي ، عد 5 إلى 10 سوميت باتجاه الرأس) وهضمها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المناسب.
  10. تحت غطاء الدخان ، انقل الأجنة إلى 4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA) في PBS معقم مرشح في أنبوب طرد مركزي دقيق (2 مل) عند 4 درجات مئوية. ثبت الأجنة من 2 ساعة إلى ليلة واحدة (O / N) عند 4 درجات مئوية على مغذي.
  11. تحت غطاء الدخان ، قم بإزالة مثبت PFA بنسبة 4٪ من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة دون لمس الأجنة. تخلص من PFA في حاوية مناسبة.
  12. اغسل الأجنة 5 مرات في PBT البارد لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  13. باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة القلب ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل مع PBT جديد.

2. مضان مناعي كامل للقلب الجنيني للفأر

  1. استبدل PBT ب PBSTr (0.4٪ Triton X-100 في PBS) واغسل العينات 3x ، 5 دقائق لكل منها ، في RT على شاكر مدالي.
  2. استبدل PBSTr بمحلول مانع (PBSTr مع مصل بقري معطل بالحرارة بنسبة 10٪). احتضان من 2 ساعة إلى O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
  3. استبدل محلول الحجب بمحلول مانع يحتوي على جسم مضاد أولي بالتركيز المطلوب (للجسم المضاد ل GFP أو الأجسام المضادة ل VE-Cadherin ، استخدم التخفيف 1: 1000). احتضان O / N على شاكر مداري عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد حضانة O / N عند 4 درجات مئوية ، احتضن لمدة 1.5 ساعة في RT على شاكر مداري. هذه الخطوة مهمة جدا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  5. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتفظ به عند 4 درجات مئوية لما يصل إلى ثلاث تجارب مستقبلية (أضف أزيد الصوديوم إلى تركيز نهائي بنسبة 0.02٪ للحصول على أفضل حفظ).
  6. اغسل الأجنة 3 مرات باستخدام PBSTr لمدة 3 دقائق لكل منها.
  7. اغسل الأجنة باستخدام PBSTr 3x لمدة 30 دقيقة لكل منها على شاكر مداري عند 4 درجات مئوية.
  8. بعد الغسل الأخير ، أضف 1 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على 1: 1000 جسم مضاد ثانوي مترافق مضان ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية. أضف أيضا 1: 3000 DAPI إلى المحلول واحتضان الأجنة O / N على شاكر مداري عند 4 درجات مئوية.
  9. بعد حضانة O / N عند 4 درجات مئوية ، احتضن لمدة 1.5 ساعة في RT على شاكر مداري. هذه الخطوة مهمة جدا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  10. اغسل الأجنة 3 مرات باستخدام PBSTr لمدة 3 دقائق لكل منها.
  11. اغسل الأجنة باستخدام PBSTr 3x-5x لمدة 30 دقيقة لكل منها على شاكر مداري في RT.

3. تركيب الماوس الجنيني AVC أو OFTs

  1. ضع القلوب على طبق بتري (35 مم) يحتوي على برنامج تلفزيوني.
  2. باستخدام سلك التنغستن والملقط الناعم ، اعزل AVC أو OFT ، وقم بقصها طوليا26.
  3. قم بإعداد أغطية (22 مم × 22 مم) ، وشرائح (60 مم × 24 مم) ، وملقط ، وماصة P200 مع الأطراف المناسبة ، ومنشفة ورقية ، وأي وسائط تثبيت مائية قائمة على الجلسرين للتألق ، بدون DAPI.
  4. باستخدام نهج مماثل كما هو الحال في Xiao، C. et al.25 ، قم بلصق شريطين من الشريط على شريحة ، مفصولة ب 0.3-0.6 سم من أجل إنشاء مساحة غرفة ثلاثية الأبعاد تسمح للعينات بالحفاظ على شكلها الأصلي دون سحقها.
  5. بعناية ، وباستخدام الحد الأدنى لحجم المخزن المؤقت ، قم بإسقاط العينات على الشريحة بين خطوط الشريط باستخدام ماصة طرف P200 مقطوعة. استخدم مجهر تشريح لزيادة الدقة.
  6. باستخدام ملقط ناعم ، ضع العينات بحيث يكون الشغاف متجها لأعلى (عضلة القلب لأسفل على الشريحة).
  7. قم بإزالة PBS الزائد بمنشفة ورقية (تجنب لمس العينة) ، ثم جفف العينات لمدة 1-2 دقيقة في RT لجعل العينات تلتصق بالشريحة.
  8. أضف 40 ميكرولتر من وسائط التركيب المائية على الأنسجة.
  9. ضع الغطاء فوق قطعتي الشريط وقم بخفضه ببطء على المنديل بإبرة أو ملقط. تجنب خلق فقاعات الهواء.
  10. أغلق غطاء الغطاء باستخدام قطرة واحدة من طلاء الأظافر على كل رأس من غطاء الغطاء.
  11. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، قم بتنظيف وسائط التثبيت الزائدة من جوانب الغطاء باستخدام منشفة ورقية ماصة. تجنب تحريك غطاء الغطاء.
  12. أضف طلاء الأظافر على طول حواف الغطاء لإغلاقه بالكامل ، مما يمنع تبخر الوسائط المتصاعدة.
  13. باستخدام مجهر متحد البؤر عمودي أو مقلوب ، التقط صورا بمعدل 10x للعرض العام وبمعدل 63x مع تكبير 3x للصور التفصيلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول أنه من الممكن إجراء en تصوير الوجه من الشغاف من AVC. كان الهدف الأول هو تحليل شكل خلية الشغاف أثناء تكوين الصمامات بدقة خلوية (الشكل 1). من أجل تسليط الضوء على خلايا الشغاف الفردية في E9.5 ، استخدمنا سلالتين من الفئران المعدلة وراثيا. (1) ROSA mT / mG هو أليل مراسل Cre فلوري بلونين (tdTomato / mT و EGFP / mG) يتم الكشف عن مضانه في غشاء الخلية. بدون التنشيط بوساطة Cre ، يعبر جين التحوير عن tdTomato (mT). عند التنشيط بوساطة Cre ، يتم استبدال تعبير tdTomato بتعبير مضان EGFP (mG) في خلايا معينة ومشتقات نسيلية27. (2) يعبر خط الماوس Cdh5CreERT2 / + عن عقار تاموكسيفين CRE-recombinase (CreERT2) تحت تنظيم محفز الكاديرين البطاني الوعائي (Cdh5) ، والذي يتم التعبير عنه في البطانة الوعائية والشغاف في المراحل الجنينية28. قمنا بعبور ذكر وأنثى من كل نمط وراثي للحصول على أجنة تحمل جينات التحوير من أجل تنشيط التعبير عن GFP في الخلايا الفردية للشغاف. لتحقيق ذلك ، قمنا بتلقيح جرعات منخفضة من عقار تاموكسيفين لتنشيط تعبير CRE في عدد أقل من الخلايا. نتيجة لذلك ، عبرت الخلايا المفردة ، أو استنساخ عدد قليل من الخلايا ، عن GFP في الشغاف (الشكل 1 أ). يعد تعبير GFP (الشكل 1A ، B) بالاشتراك مع توطين VE-Cadherin تحت الخلوي (الشكل 1C) طريقة فعالة لدراسة العلاقة بين ديناميكيات AJ وتكوين الفيلوبوديا في خلايا ما قبل EMT لأن هذه الخلايا تطور نتوءات غشائية حيث تذوب AJs29. يمكن أن تمنح إشارات PCP انقباضا متباين الخواص على AJs ، مما ينتج عنه قوى خلوية تعزز التشكل المستقطب في الظهارة30. وجدنا اختلافات في شدة تلطيخ VE-Cadherin في الشغاف (الشكل 2) ، مما يشير إلى أنه لا يمكننا تجاهل انقباض متباين الخواص في الشغاف الجنيني ل AVC في مراحل ما قبل الصمام.

كان الهدف الثاني هو تحليل الطوبولوجيا المستوية للشغاف أثناء تطوير الصمام (الشكل 2). من أجل تحديد عدد الخلايا المتقاربة في رأس واحد ، قمنا بتلطيخ القلب كله بالجسم المضاد VE-Cadherin عند E8.5 و E9.5 (الشكل 2 أ ، ب). الجزيئات الأخرى المترجمة عند ملامسات الخلايا الخلوية لخلية الشغاف ستكون مفيدة أيضا لهذا الغرض (على سبيل المثال ، β-Catenin). في E8.5 ، يميل الشغاف في AVC إلى أن يكون له تنظيم ظهاري مستقر ، ولم نتمكن من اكتشاف الرؤوس المكونة من أكثر من أربع خلايا (الشكل 2A ، C). في وقت لاحق في E9.5 ، وجدنا رؤوسا مكونة من ما يصل إلى ست خلايا تشكل هياكل تشبه الوردة (الشكل 2B ، D) ، على غرار التنظيم الخلوي الموصوف سابقا في الظهارة التي تخضع لإعادة ترتيب الخلايا النشطة31 ، مما يشير إلى أن الشغاف AVC يخضع لإعادة ترتيب خلوي نشط أثناء تطوير الصمام.

Figure 1
الشكل 1: تحليل شكل الخلية الواحدة في الشغاف قبل الصمام. (أ) فتح AVC من جنين الفأر E9.5 طوليا ليظهر خلايا موجبة GFP متناثرة. (ب) يحدد تعبير GFP في الخلايا المفردة شكل الخلية بدقة خلوية. (ج) تلطيخ كامل التركيب ل VE-Cadherin يسلط الضوء على AJs. يتم إنشاء Filopodia في مجالات الخلية التي لا تقوم بتوطين VE-Cadherin (الأسهم الأرجواني) ، والعكس صحيح ، يتم توطين VE-Cadherin في مجالات الخلية الملساء ولا تشكل filopodia (رؤوس الأسهم الزرقاء). الخامس ، البطني. د ، الظهرية. شريط المقياس في A هو 100 ميكرومتر ؛ في B و C هو 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: يمكن تعريف الطوبولوجيا المستوية وتباين الخواص للبروتينات الموضعية المستوية في صور الوجه للشغاف في القناة الأذينية البطينية. يتم توطين VE-Cadherin في ملامسات الخلايا الخلوية في الشغاف. (أ) E8.5 و (ب) E9.5 AVC من الأجنة فتحا طوليا. سمح لنا التكبيران في الخيارين (ج) و(د) بملاحظة عدد الخلايا التي تتقارب في الرأس. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا التمييز بين الشدة المختلفة في تلطيخ VE-Cadherin ، مما يشير إلى أن موقعه في AVC متباين الخواص. شريط المقياس في A و B هو 100 ميكرومتر ؛ في C و D هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الشغاف عبارة عن طبقة أحادية ظهارية تغطي السطح الداخلي لأنبوب القلب الجنيني بالكامل. أثناء تطور الصمام ، تخضع خلايا الشغاف في مناطق الصمامات المحتملة ل EMT ، وبالتالي تقوم خلايا الشغاف بتحويل وإعادة ترتيب هيكلها الخلوي للانفصال من الشغاف نحو الهلام القلبي. لقد حصلنا نحن وآخرون على البيانات ذات الصلة حول تطور الصمام في أجنة الفئران من خلال تحليل المقاطع المستعرضة للقلوب الجنينية E8.5 و E9.5 ، حيث يظهر الشغاف كصف من الخلايا6،8،24،32. سمح هذا النهج بتحليل التعبير عن مسارات الإشارات والجزيئات الأخرى المشاركة في تطوير الصمام ، ولكن لم يكن من الممكن تحليل الجوانب المكانية للشغاف قبل الصمام.

تم استخدام نباتات AVC أو OFT بشكل أساسي لدراسة تحويل EC على هلام الكولاجين 3D. Explants مفيدة للقياس الكمي EMT ، أو تحليل قدرة التحويل ، أو اختبار الأدوية بعد أيام قليلة في الثقافة6،7،11،33. تسمح هذه التجارب خارج الجسم الحي أيضا بتوسيع الشغاف فوق هلام الكولاجين كطبقة أحادية ، لكن الظروف البيئية التي تزرع فيها النباتات القلبية خارج الجسم الحي تختلف عنها في ظروف الرحم. على سبيل المثال ، يعد تدفق الدم أحادي الاتجاه ضروريا لتطوير الصمامالسليم 34,35 ولا يتحقق إلا في الرحم ، وليس في النباتات خارج الجسم الحي.

يسمح لنا هذا النهج الجديد بمراقبة الشغاف الصمامي السليم en وجه أثناء بداية تطور الصمام دون أي تلاعب بيئي. يسمح بتحليل التوزيع الخلوي للشغاف الصمامي ، وكذلك تحليل شكل الخلية الواحدة قبل وأثناء EMT في ظروف الرحم . يمكننا أيضا مراقبة وتحليل شدة وتنظيم اتصالات الخلية الخلوية والتوزيع تحت الخلوي للجزيئات ذات الصلة أثناء EMT. توفر هذه التقنية أيضا إمكانية تحليل الهياكل تحت الخلوية للشغاف ، وتنشيط مسارات الإشارات باستخدام جينات المراسل ، والتأثير الذي قد يحدثه تعطيل الجينات على السلوك الخلوي ، وكيف يمكن أن يؤثر على الخلايا المجاورة من النوع البري.

للحصول على عينات عالية الجودة ، من المهم توخي الحذر الشديد عند التعامل معها ، لأن الشوائب (مثل الألياف الدقيقة) التي تلتصق بالأنسجة يمكن أن تؤدي إلى قطع أثرية أثناء التقاط الصور. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنها عينات صغيرة جدا ، فإن خطر الكسر مرتفع ، لذلك يجب على المرء غسل الأنسجة (الخطوة 1. والخطوة 2.) في الهزازات البطيئة. أثناء تغيير الوسائط باستخدام الماصات ، نوصي بقطع الطرف لمنع الأنسجة من الانهيار أثناء مرورها عبر الطرف في حالة امتصاصها عن طريق الخطأ. لتصبح خبيرا في هذه التقنية ، من الضروري وجود منحنى تعليمي ، والذي سيكون أطول أو أقصر اعتمادا على خبرة الباحث السابقة في المعالجة الدقيقة.

يمكن أن يكون اختيار المثبت الصحيح ووقت التثبيت مهما في حالة استخدام الجينات المحورة التي تعبر عن البروتينات الفلورية. لا يتأثر التركيب التشريحي بمثبتات مختلفة مثل الإيثانول 70٪ أو الميثانول أو PFA 4٪ أو الفورمالين 10٪.

من أجل تلطيخ النوى ، نوصي بحضانة العينات باستخدام DAPI لأن الاختراق أكثر كفاءة من استخدام وسائط التركيب مع DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة بالمنح PID2019-104776RB-I00 و CB16/11/00399 (CIBER CV) من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 إلى J. L. P. J.G.-B. تم تمويله من قبل برنامج Atracción de Talento من Comunidad de Madrid (2020-5ª / BMD-19729). تي جي سي. بتمويل من منظمة Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). نشكر وحدة CNIC للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، ICTS-ReDib ، بتمويل مشترك من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 و FEDER "طريقة لجعل أوروبا" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). نشكر أيضا A. Galicia و L. Méndez على تربية الفئران. ودعمت تكلفة هذا المنشور جزئيا بأموال من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية. يتم دعم CNIC من قبل ISCIII و MCIN ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (منحة CEX2020-001041-S) بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 185 ،
<em>En Face</em> تحضير وسادة الشغاف لتحليل التشكل المستوي في أجنة الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter