Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En ansigt Endokardial pudepræparat til plan morfogeneseanalyse i museembryoner

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

Klassisk er endokardiet af musens embryonale ventil primordium blevet analyseret ved hjælp af tværgående, koronale eller sagittale sektioner. Vores nye tilgang til en face, todimensionel billeddannelse af endokardiet i valvulogene regioner tillader plan polaritet og celleomlejringsanalyse af endokardiet under ventiludvikling.

Abstract

Undersøgelsen af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af pattedyrshjertet, er afgørende for at løse menneskelig medfødt hjertesygdom. Udviklingen af de primitive hjerteventiler involverer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) af endokardialceller fra atrioventrikulær kanal (AVC) og udstrømningskanal (OFT) regioner i hjertet som reaktion på lokale induktive myokardie- og endokardiale signaler. Når cellerne delaminerer og invaderer den ekstracellulære matrix (hjertegelé), der er placeret mellem endokardiet og myokardiet, dannes de primitive endokardiepuder (EC). Denne proces indebærer, at endokardiet skal udfylde hullerne efter de delaminerede celler og skal omorganisere sig for at konvergere (smal) eller strække sig (forlænges) langs en akse. Nuværende forskning har impliceret den plane cellepolaritet (PCP) vej til regulering af den subcellulære lokalisering af de faktorer, der er involveret i denne proces. Klassisk set er de indledende faser af udviklingen af hjerteklappen blevet undersøgt i tværsnit af embryonale hjerter eller i ex vivo AVC- eller OFT-eksplanter, der dyrkes på kollagengeler. Disse tilgange tillader analyse af apico-basal polaritet, men tillader ikke analyse af celleadfærd inden for epitelets plan eller af de morfologiske ændringer af migrerende celler. Her viser vi en eksperimentel tilgang, der tillader visualisering af endokardiet ved valvulogene regioner som et plant felt af celler. Denne eksperimentelle tilgang giver mulighed for at studere PCP, plan topologi og intercellulær kommunikation inden for endokardiet i OFT og AVC under ventiludvikling. Dekryptering af nye cellulære mekanismer involveret i hjerteventilmorfogenese kan bidrage til at forstå medfødt hjertesygdom forbundet med endokardiale pudefejl.

Introduction

Hjertet er det første funktionelle organ i et pattedyrembryo. Omkring fosterdag (E) 7,5 hos mus danner bilaterale prækardiale mesodermceller hjertehalvmånen i den ventrale side1. Hjertehalvmånen indeholder to populationer af prækardiale celler, der omfatter forfædre til myokardiet og endokardiet2. Omkring E8.0 smelter hjerteforstadierne sammen i midterlinjen og danner det primitive hjerterør bestående af to epitelvæv, det ydre myokardium og det indre endokardium, som er et specialiseret endotel adskilt af en ekstracellulær matrix ved navn hjertegelé. Senere, ved E8.5, gennemgår hjerterøret højre looping. Det loopede hjerte har forskellige anatomiske regioner med specifikke molekylære signaturer såsom udstrømningskanalen (OFT), ventriklerne og atrio-ventrikulær kanal (AVC)3. Selvom hjerterøret oprindeligt udvider sig ved sin tilstrømningsside gennem tilsætning af celler4, ved E9.5, resulterer intensiv hjerteproliferation i ballondannelse af kamrene og etablering af det trabekulære netværk5. Ventildannelse finder sted i AVC (fremtidige mitral- og tricuspidventiler) og i OFT (fremtidige aorta- og lungeventiler).

Endokardiet spiller afgørende roller i ventiludvikling. Endokardiale celler gennemgår epitel-mesenkymal overgang (EMT) i AVC og OFT for at danne endokardialpuderne, en struktur, der vises ved begyndelsen af ventiludviklingen. Forskellige signalveje aktiverer denne proces; ved E9.5 hos mus fremmer NOTCH aktiveret i endokardiet som reaktion på myokardieafledt BMP2 invasiv EMT af endokardieceller i AVC- og OFT-regionerne gennem aktivering af TGFβ2 og SNAIL (SNAI1), som direkte undertrykker ekspressionen af vaskulær endotelcadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i klæbende kryds (AJ'er)6,7,8 . I OFT medieres aktivering af endokardiet for at initiere EMT af FGF8 og BMP4, hvis udtryk aktiveres af NOTCH 9,10,11,12.

Progression af EMT involverer cellulær dynamik, når celler ændrer form, bryder og genskaber kryds med deres naboer, delaminerer og begynder at migrere13. Disse ændringer omfatter AJ-ombygning og gradvis demontering af 14,15, plan cellepolaritet (PCP) signalering, tab af apico-basal polaritet (ABP), apikal indsnævring og cytoskeletal organisation 16,17. ABP refererer til fordelingen af proteiner langs den forreste bageste akse af en celle. I det udviklende hjerte kræves ABP-regulering i kardiomyocytter til ventrikulær udvikling18. PCP refererer til en polariseret fordeling af proteiner i celler på tværs af et vævs plan og regulerer cellulær fordeling; epitel med en stabil geometri består af sekskantformede celler, hvor kun tre celler konvergerer ved hjørnerne 19,20,21,22. Forskellige cellulære processer, såsom celledeling, naboudveksling eller delaminering, der forekommer under epitelmorfogenese, producerer en stigning i antallet af celler, der konvergerer på et toppunkt, og antallet af naboceller, som en given celle har22. Disse cellulære adfærd relateret til PCP kan reguleres af forskellige signalveje, actindynamik eller intracellulær handel23.

De data, der genereres ved at studere ventiludvikling hos mus, er opnået fra tværgående, koronale eller sagittale sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet vises som en cellelinje i stedet for som et felt af celler - endokardiet dækker hele den indre overflade af hjerterøret24. Embryonale sektioner tillader ikke analyse af PCP i endokardiet af museembryoner. Vores nye eksperimentelle metode tillader analyse af endokardialcellefordeling, AJ-anisotropi og enkeltcelleformanalyse, som vist i de repræsentative resultater. Denne type data er nødvendig for PCP-analyse sammen med beskrivelsen af andre molekyler relateret til PCP, som ikke er vist i denne rapport. Helmonteret immunfluorescens, specifik prøveforberedelse og anvendelse af genetisk modificerede mus muliggør plan polaritetsanalyse i endokardiet ved begyndelsen af ventiludvikling hos mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee og af Madrid Community (ref. PROEX 155.7/20). Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63EU og henstilling 2007/526/EF om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, der er vedtaget i spansk lovgivning i henhold til Real Decreto 1201/2005.

1. Obtention af AVC og / eller OFT'er (tilpasset fra Xiao et al. 25)

  1. Opret kryds om eftermiddagen mellem kvindelig mTmG og mandlig VE-Cadherin-Cre-ERT / +.
  2. Næste morgen skal du tjekke for en vaginal plug. Hvis der er en vaginal plug, tælle det som en halv dag (E0.5). Afhængigt af eksperimentet af interesse skal du tælle 8 dage eller 9 dage.
  3. 24 timer før dissektion giver den gravide kvinde oralt med 50 μL 5 mg/ml 4-OH-Tamoxifen fortyndet i majsolie.
    BEMÆRK: Denne dosis vil inducere en begrænset mængde CRE-medieret rekombination afsløret ved tilstedeværelsen af GFP-positive kloner. Den passende dosis skal bestemmes med hver ny batch af 4-OH-Tamoxifen.
  4. Ofr den gravide kvinde ved E8.5 eller E9.5 ved cervikal dislokation.
  5. Åbn maven på de gravide mus ved hjælp af en saks og fjern livmoderen, der indeholder embryonerne, ved hjælp af saks og finpincet.
  6. Placer livmoderen i en petriskål indeholdende iskold 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) med 0,1% Tween-20 (PBT).
  7. Fjern den enkelte deciduae fra livmoderen under et dissekerende mikroskop og brug fine tang.
  8. Brug en fin pincet til at lave et snit i den hvide del af løvfælden, hvor embryoet er, fjern det forsigtigt, undgå at trække, og overfør embryonerne til en ny petriskål med frisk PBT ved hjælp af en P1000 med spidsen afskåret, hvilket efterlader en diameter, der er stor nok til, at et embryo kan passere igennem uden at bryde.
  9. Til genotypning skal du tage et lille stykke æggeblomme sac (0,5 mm2) eller et stykke af halen (fra den bageste ende, tælle 5 til 10 somitter mod hovedet) og fordøje det i 100 μL passende buffer.
  10. Under røghætten overføres embryonerne til iskold 4% paraformaldehyd (4% PFA) i sterilt filtreret PBS i et mikrocentrifugerør (2 ml) ved 4 °C. Embryonerne fastgøres fra 2 timer til natten over (O/N) ved 4 °C på en nøddemaskine.
  11. Under røghætten fjernes 4% PFA-fikseringsmidlet fra mikrocentrifugerørene uden at røre embryonerne. Kassér PFA'en i en passende beholder.
  12. Embryonerne vaskes 5x i kold PBT i 10 minutter hver ved stuetemperatur (RT).
  13. Brug fine tang til at fjerne hjertet og overføre det til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør med frisk PBT.

2. Hele monteringsimmunfluorescens af musens embryonale hjerte

  1. Udskift PBT med PBSTr (0,4% Triton X-100 i PBS) og vask prøverne 3x, 5 min hver, ved RT på en orbital shaker.
  2. Udskift PBSTr med blokerende opløsning (PBSTr med 10% varmeinaktiveret bovint serum). Der inkuberes fra 2 timer til O/N ved 4 °C på en orbitalryster.
  3. Erstat blokeringsopløsning med blokerende opløsning indeholdende primært antistof i den ønskede koncentration (til anti-GFP eller anti-VE-Cadherin antistof,brug 1:1000 fortynding). Der inkuberes O/N på en orbital shaker ved 4 °C.
  4. Efter O/N-inkubation ved 4 °C inkuberes i 1,5 timer ved RT på en orbitalryster. Dette trin er meget vigtigt for at øge signal-støj-forholdet.
  5. Den primære antistofopløsning fjernes og opbevares ved 4 °C i op til tre fremtidige forsøg (tilsæt natriumazid til en slutkoncentration på 0,02 % for at opnå den bedste konservering).
  6. Vask embryonerne 3x med PBSTr i 3 minutter hver.
  7. Embryonerne vaskes med PBSTr 3x i 30 minutter hver på en orbital shaker ved 4 °C.
  8. Efter den sidste vask tilsættes 1 ml blokerende opløsning indeholdende 1:1000 fluorescenskonjugeret sekundært antistof mod den primære antistofværtsart. Der tilsættes også 1:3000 DAPI til opløsningen, og embryonerne O/N inkuberes på en orbitalryster ved 4 °C.
  9. Efter O/N-inkubation ved 4 °C inkuberes i 1,5 timer ved RT på en orbitalryster. Dette trin er meget vigtigt for at øge signal-støj-forholdet.
  10. Vask embryonerne 3x med PBSTr i 3 minutter hver.
  11. Embryonerne vaskes med PBSTr 3x-5x i 30 minutter hver på en orbital shaker ved RT.

3. Montering af musens embryonale AVC eller OFT'er

  1. Læg hjerterne på en petriskål (35 mm) indeholdende PBS.
  2. Brug en wolframtråd og fine tang til at isolere AVC eller OFT og skære dem i længderetningen26.
  3. Forbered dækslips (22 mm x 22 mm), dias (60 mm x 24 mm), tang, en P200-pipette med de relevante spidser, papirhåndklæde og vandige glycerolbaserede monteringsmedier til fluorescens uden DAPI.
  4. Brug en lignende tilgang som i Xiao, C. et al.25, sæt to strimler tape på et dias, adskilt af 0,3-0,6 cm for at skabe et 3D-rumrum, der gør det muligt for prøverne at bevare den oprindelige form uden at knuse dem.
  5. Forsigtigt og ved hjælp af den mindste buffervolumen slippes prøverne på diaset mellem båndstriberne ved hjælp af en skåret P200 spidspipette. Brug et dissekeringsmikroskop til at øge nøjagtigheden.
  6. Brug fine tang til at placere prøverne med endokardiet opad (myokardium ned på diaset).
  7. Fjern overskydende PBS med et papirhåndklæde (undgå at røre ved prøven), og tør derefter prøverne i 1-2 minutter ved RT for at få prøverne til at klæbe til diaset.
  8. Tilsæt 40 μL vandige baserede monteringsmedier på vævet.
  9. Placer dækslet over de to stykker tape og sænk det langsomt ned på vævet med en nål eller tang. Undgå at skabe luftbobler.
  10. Forsegl dækslippen ved hjælp af en dråbe neglelak på hvert toppunkt på dækslip.
  11. Når neglelakken er tør, skal du rengøre det overskydende monteringsmedie fra siderne af dækslikket ved hjælp af et absorberende papirhåndklæde. Undgå at flytte dækslip.
  12. Tilføj neglelak langs dækslipkanterne for at forsegle det helt, hvilket forhindrer fordampning af monteringsmedier.
  13. Brug et lodret eller et omvendt konfokalmikroskop til at tage billeder ved 10x til generel visning og ved 63x med 3x zoom for detaljerede billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De data, der genereres ved hjælp af denne protokol, viser, at det er muligt at udføre en ansigtsbilleddannelse af AVC's endokardium. Det første mål var at analysere endokardiets celleform under dannelsen af ventilerne ved en cellulær opløsning (figur 1). For at fremhæve individuelle endokardieceller ved E9.5 brugte vi to transgene musestammer. (1) ROSAmT/mG er en tofarvet fluorescerende Cre reporter-allel (tdTomato/mT og EGFP/mG), hvis fluorescens detekteres ved cellemembranen. Uden Cre-medieret aktivering udtrykker transgenet tdTomato (mT). Ved Cre-medieret aktivering erstattes tdTomato-ekspression med EGFP-fluorescensekspression (mG) i specifikke celler og klonale derivater27. (2) Cdh5CreERT2/+ muselinjen udtrykker tamoxifen-inducerbar CRE-rekombinase (CreERT2) under regulering af den vaskulære endotel-cadherinpromotor (Cdh5), som udtrykkes i det vaskulære endotel og endokardiet i embryonale stadier28. Vi krydsede en mand og en kvinde af hver genotype for at opnå embryoner, der bærer de to transgener for at aktivere ekspressionen af GFP i individuelle celler i endokardiet. For at opnå dette podede vi lave doser af tamoxifen for at aktivere CRE-ekspression i et reduceret antal celler. Som følge heraf udtrykte enkeltceller eller kloner af få celler GFP i endokardiet (figur 1A). GFP-ekspression (figur 1A, B) i kombination med VE-Cadherin subcellulær lokalisering (figur 1C) er en effektiv tilgang til at studere forholdet mellem AJ-dynamik og filopodidannelse i præ-EMT-celler, da disse celler udvikler membranfremspring, når AJ'er opløses29. PCP-signaler kan give anisotrop kontraktilitet til AJ'erne og producere cellulære kræfter, der fremmer polariseret morfogenese i epitel30. Vi fandt forskelle i intensiteten af VE-Cadherin-farvning i endokardiet (figur 2), hvilket indikerer, at vi ikke kan kassere anisotrop kontraktilitet i AVC's embryonale endokardium i prævalvulære stadier.

Det andet mål var at analysere endokardiets plane topologi under ventiludvikling (figur 2). For at definere antallet af celler, der konvergerer i et enkelt toppunkt, farvede vi hele hjertet med VE-Cadherin-antistof ved E8.5 og E9.5 (figur 2A, B). Andre molekyler lokaliseret ved cellecellekontakter i endokardialcellen ville også være nyttige til dette formål (f.eks. β-Catenin). Ved E8.5 har endokardiet i AVC tendens til at have en stabil epitelorganisation, og vi kunne ikke detektere hjørner dannet af mere end fire celler (figur 2A, C). Senere på E9.5 fandt vi hjørner, der består af op til seks celler, der danner rosetlignende strukturer (figur 2B, D), svarende til den cellulære organisation, der tidligere er beskrevet i epitelia, der gennemgår aktive celleomlejringer31, hvilket tyder på, at AVC-endokardiet gennemgår aktiv cellulær omlejring under ventiludvikling.

Figure 1
Figur 1: Enkeltcelleformet analyse i prævalvulært endokardium. (A) AVC fra E9.5 museembryo åbnet i længderetningen og viste spredte GFP-positive celler. (B) GFP-ekspression i enkeltceller definerer celleform ved cellulær opløsning. (C) Helmonteret farvning af VE-Cadherin fremhæver AJ'er. Filopodia genereres i domæner af cellen, der ikke lokaliserer VE-Cadherin (lilla pile), og omvendt lokaliserer VE-Cadherin i domæner af cellen, der er glatte og ikke danner filopodia (blå pilespidser). v, ventral; d, dorsal. Skala bar i A er 100 μm; i B og C er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Plan topologi og anisotropi af planmæssigt lokaliserede proteiner kan defineres i en face billeder af endokardium ved AV-kanalen. VE-Cadherin er lokaliseret ved endokardiets celle-cellekontakter. (A) E8.5 og (B) E9.5 AVC fra embryoner blev åbnet i længderetningen. Forstørrelser i (C) og (D) tillod os at observere antallet af celler, der konvergerer i et toppunkt. Derudover kan vi skelne mellem forskellige intensiteter i VE-Cadherin-farvningen, hvilket indikerer, at dens placering i AVC er anisotropisk. Skala bar i A og B er 100 μm; i C og D er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endokardiet er et epitelmonolag, der dækker hele den indre overflade af det embryonale hjerterør. Under ventiludvikling gennemgår endokardialceller i de potentielle valvulære regioner EMT, således omdanner endokardialceller og omarrangerer deres cytoskelet for at delaminere fra endokardiet mod hjertegeléen. Vi og andre har opnået relevante data om ventiludvikling i museembryoner ved at analysere tværgående sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en række celler 6,8,24,32. Denne tilgang tillod analyse af ekspressionen af signalveje og andre molekyler involveret i ventiludvikling, men det var ikke muligt at analysere rumlige aspekter af præ-valvulær endokardium.

AVC- eller OFT-eksplanterne blev hovedsageligt brugt til at studere transformerende EC på en 3D-kollagengel. Explants er nyttige til EMT-kvantificering, analyse af transformationskapacitet eller test af lægemidler efter få dage i kultur 6,7,11,33. Disse ex vivo-eksperimenter tillader også udvidelse af endokardiet oven på kollagengelen som et monolag, men de miljøforhold, hvorunder ex vivo hjerteplanter dyrkes, adskiller sig fra i utero-forhold. For eksempel er ensrettet blodgennemstrømning afgørende for korrekt ventiludvikling34,35 og opnås kun i in utero, ikke i ex vivo, explants.

Denne nye tilgang giver os mulighed for at observere det intakte valvulære endokardium et ansigt under begyndelsen af ventiludvikling uden nogen miljømanipulation. Det tillader analyse af den cellulære fordeling af valvulær endokardiet samt enkeltcelleformanalyse før og under EMT i in utero-forhold . Vi kan også observere og analysere intensiteten og organisationen af cellecellekontakterne og den subcellulære fordeling af relevante molekyler under EMT. Denne teknik giver også mulighed for at analysere endokardiets subcellulære strukturer, aktivering af signalveje ved hjælp af reportergener, den effekt, som geninaktivering kan have på cellulær adfærd, og hvordan det kan påvirke vildtype naboceller.

For at opnå prøver af høj kvalitet er det vigtigt at være meget forsigtig, når du håndterer dem, da urenheder (f.eks. Mikrofibre), der klæber til vævet, kan resultere i artefakter under optagelse af billeder. Da der er tale om meget små prøver, er risikoen for at knække desuden høj, så man skal vaske vævet (trin 1. og trin 2.) i slow shakers. Under skift af medier med pipetter anbefaler vi at afskære spidsen for at forhindre vævet i at kollapse, når det passerer gennem spidsen i tilfælde af, at det ved et uheld absorberes. For at blive ekspert i denne teknik er det nødvendigt med en indlæringskurve, som vil være længere eller kortere afhængigt af forskerens tidligere erfaring med mikromanipulation.

At vælge det rigtige fikseringsmiddel og tidspunktet for fiksering kan være vigtigt i tilfælde af brug af transgener, der udtrykker fluorescerende proteiner. Den anatomiske struktur påvirkes ikke af forskellige fikseringsmidler såsom ethanol 70%, methanol, PFA 4% eller formalin 10%.

Til modfarvning af kerner anbefaler vi inkubation af prøver med DAPI, fordi penetration er meget mere effektiv end at bruge monteringsmedier med DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud PID2019-104776RB-I00 og CB16/11/00399 (CIBER CV) fra MCIN/AEI/10.13039/501100011033 til J. L. P. J.G.-B. blev finansieret af Programa de Atracción de Talento fra Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. blev finansieret af Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi takker CNIC-enheden for mikroskopi og dynamisk billeddannelse, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansieret af MCIN/AEI /10.13039/501100011033 og FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi takker også A. Galicien og L. Méndez for museopdræt. Udgifterne til denne publikation blev delvist støttet af midler fra Den Europæiske Fond for Regionaludvikling. CNIC er støttet af ISCIII, MCIN og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (tilskud CEX2020-001041-S) finansieret af MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 185
<em>En ansigt</em> Endokardial pudepræparat til plan morfogeneseanalyse i museembryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter