Summary
Classiquement, l’endocarde de la valve embryonnaire de souris primordium a été analysé en utilisant des coupes transversales, coronales ou sagittales. Notre nouvelle approche pour l’imagerie bidimensionnelle en face de l’endocarde dans les régions valvulogéniques permet une analyse de polarité plane et de réarrangement cellulaire de l’endocarde pendant le développement valvulaire.
Abstract
L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au développement du cœur des mammifères est essentielle pour traiter les cardiopathies congénitales humaines. Le développement des valves cardiaques primitives implique la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) des cellules endocardiques du canal auriculo-ventriculaire (AVC) et des voies d’écoulement (OFT) du cœur en réponse à des signaux myocardiques et endocardiques inductifs locaux. Une fois que les cellules se délaminent et envahissent la matrice extracellulaire (gelée cardiaque) située entre l’endocarde et le myocarde, les coussins endocardiques primitifs (EC) se forment. Ce processus implique que l’endocarde doit combler les lacunes laissées par les cellules délaminées et doit se réorganiser pour converger (étroit) ou s’étendre (allonger) le long d’un axe. Les recherches actuelles ont impliqué la voie de polarité cellulaire planaire (PCP) dans la régulation de la localisation subcellulaire des facteurs impliqués dans ce processus. Classiquement, les phases initiales du développement valvulaire cardiaque ont été étudiées dans des coupes transversales de cœurs embryonnaires ou dans des explants ex vivo AVC ou OFT cultivés sur des gels de collagène. Ces approches permettent l’analyse de la polarité apico-basale mais ne permettent pas l’analyse du comportement cellulaire dans le plan de l’épithélium ou des changements morphologiques des cellules migrantes. Ici, nous montrons une approche expérimentale qui permet la visualisation de l’endocarde dans les régions valvulogènes en tant que champ planaire de cellules. Cette approche expérimentale offre la possibilité d’étudier le PCP, la topologie plane et la communication intercellulaire au sein de l’endocarde de l’OFT et de l’AVC pendant le développement de la valve. Déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires impliqués dans la morphogenèse valvulaire cardiaque peut contribuer à la compréhension des cardiopathies congénitales associées aux anomalies du coussin endocardique.
Introduction
Le cœur est le premier organe fonctionnel d’un embryon de mammifère. Vers le jour embryonnaire (E) 7,5 chez la souris, les cellules bilatérales du mésoderme précardiaque forment le croissant cardiaque dans la face ventrale1. Le croissant cardiaque contient deux populations de cellules précardiaques qui comprennent les progéniteurs du myocarde et de l’endocarde2. Vers E8.0, les précurseurs cardiaques fusionnent dans la ligne médiane, formant le tube cardiaque primitif composé de deux tissus épithéliaux, le myocarde externe et l’endocarde interne, qui est un endothélium spécialisé séparé par une matrice extracellulaire appelée gelée cardiaque. Plus tard, à E8.5, le tube cardiaque subit une boucle vers la droite. Le cœur en boucle possède différentes régions anatomiques avec des signatures moléculaires spécifiques telles que le tractus d’écoulement (OFT), les ventricules et le canal atrio-ventriculaire (AVC)3. Bien qu’initialement le tube cardiaque se dilate à son entrée par l’ajout de cellules4, à E9.5, la prolifération cardiaque intensive entraîne un gonflement des cavités et l’établissement du réseau trabéculaire5. La formation valvulaire a lieu dans l’AVC (futures valves mitrales et tricuspides) et dans l’OFT (futures valves aortiques et pulmonaires).
L’endocarde joue un rôle crucial dans le développement de la valve. Les cellules endocardiques subissent une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) dans l’AVC et l’OFT pour former les coussins endocardiques, une structure qui apparaît au début du développement valvulaire. Différentes voies de signalisation activent ce processus; à E9,5 chez la souris, NOTCH activé dans l’endocarde en réponse à BMP2 dérivé du myocarde favorise l’EMT invasive des cellules endocardiques dans les régions AVC et OFT par l’activation de TGFβ2 et SNAIL (SNAI1), qui réprime directement l’expression de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine), un composant transmembranaire des jonctions adhérentes (AJ)6,7,8 . Dans l’OFT, l’activation de l’endocarde pour initier l’EMT est médiée par FGF8 et BMP4, dont l’expression est activée par NOTCH 9,10,11,12.
La progression de l’EMT implique une dynamique cellulaire lorsque les cellules changent de forme, rompent et refont des jonctions avec leurs voisines, se délaminent et commencent à migrer13. Ces changements comprennent le remodelage et le désassemblage progressif de l’AJ 14,15, la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP), la perte de polarité apico-basale (ABP), la constriction apicale et l’organisation cytosquelettique 16,17. Le PBA fait référence à la distribution des protéines le long de l’axe antéro-postérieur d’une cellule. Dans le cœur en développement, la régulation ABP dans les cardiomyocytes est nécessaire pour le développement ventriculaire18. La PCP fait référence à une distribution polarisée de protéines dans les cellules à travers le plan d’un tissu et régule la distribution cellulaire; Les épithéliums à géométrie stable sont constitués de cellules en forme d’hexagone, où seulement trois cellules convergent aux sommets 19,20,21,22. Différents processus cellulaires, tels que la division cellulaire, l’échange de voisins ou la délamination se produisant au cours de la morphogenèse épithéliale, produisent une augmentation du nombre de cellules qui convergent vers un sommet et du nombre de cellules voisines qu’une cellule donnée a22. Ces comportements cellulaires liés à la PCP peuvent être régulés par différentes voies de signalisation, la dynamique de l’actine ou le trafic intracellulaire23.
Les données générées pour étudier le développement valvulaire chez la souris ont été obtenues à partir de coupes transversales, coronales ou sagittales de cœurs embryonnaires E8.5 et E9.5, où l’endocarde est représenté comme une ligne de cellules plutôt que comme un champ de cellules - l’endocarde couvre toute la surface interne du tube cardiaque24. Les coupes embryonnaires ne permettent pas l’analyse de la PCP dans l’endocarde des embryons de souris. Notre nouvelle méthode expérimentale permet l’analyse de la distribution des cellules endocardiques, de l’anisotropie AJ et de l’analyse de la forme d’une seule cellule, comme le montrent les résultats représentatifs. Ce type de données est nécessaire pour l’analyse du PCP, ainsi que la description d’autres molécules liées au PCP, non présentées dans ce rapport. L’immunofluorescence à montage entier, la préparation d’échantillons spécifiques et l’utilisation de souris génétiquement modifiées permettent une analyse de polarité planaire dans l’endocarde au début du développement valvulaire chez la souris.
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Protocol
Les études animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) et par la Communauté de Madrid (réf. PROEX 155.7/20). Toutes les procédures relatives aux animaux étaient conformes à la directive européenne 2010/63UE et à la recommandation 2007/526/CE concernant la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques, promulguée dans la loi espagnole en vertu du Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention de CVA et/ou d’OFT (adapté de Xiao et al. 25)
- Mettez en place des croisements dans l’après-midi entre la femelle mTmG et le mâle VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
- Le lendemain matin, vérifiez s’il y a un plug vaginal. S’il y a un plug vaginal, comptez-le comme une demi-journée (E0,5). Selon l’expérience d’intérêt, comptez 8 jours ou 9 jours.
- 24 h avant la dissection, gavage de la femelle enceinte par voie orale avec 50 μL de 4-OH-tamoxifène à 5 mg/mL dilué dans de l’huile de maïs.
NOTE: Cette dose induira une quantité limitée de recombinaison médiée par CRE révélée par la présence de clones GFP-positifs. La dose appropriée devra être déterminée avec chaque nouveau lot de 4-OH-tamoxifène. - Sacrifier la femelle enceinte à E8.5 ou E9.5 par luxation cervicale.
- Ouvrez l’abdomen des souris gravides à l’aide de ciseaux et retirez l’utérus contenant les embryons à l’aide de ciseaux et de fines pinces.
- Placez l’utérus dans une boîte de Petri contenant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée avec 0,1% de Tween-20 (PBT).
- Retirez les déciduae individuelles de l’utérus au microscope à dissection et à l’aide de pinces fines.
- À l’aide d’une pince à épiler fine, faites une incision dans la partie blanche de la décidue, où se trouve l’embryon, retirez-le doucement, en évitant de tirer, et transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Petri avec du PBT frais à l’aide d’un P1000 avec la pointe coupée, laissant un diamètre suffisamment grand pour qu’un embryon puisse passer à travers sans se casser.
- Pour le génotypage, prenez un petit morceau du sac vitellin (0,5 mm2) ou un morceau de la queue (de l’extrémité postérieure, en comptant 5 à 10 somites vers la tête) et digérez-le dans 100 μL de tampon approprié.
- Sous la hotte, transférer les embryons dans du paraformaldéhyde glacé à 4 % (PFA à 4 %) dans du PBS filtré stérile dans un tube microcentrifuge (2 mL) à 4 °C. Fixer les embryons de 2 h à une nuit (O/N) à 4 °C sur un nutator.
- Sous la hotte, retirer le fixateur PFA à 4 % des tubes microcentrifugeux sans toucher les embryons. Jeter le PFA dans un contenant approprié.
- Laver les embryons 5x dans du PBT froid pendant 10 minutes chacun à température ambiante (RT).
- À l’aide d’une pince fine, retirez le cœur et transférez-le dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant du PBT frais.
2. Immunofluorescence de monture entière du cœur embryonnaire de souris
- Remplacez PBT par PBSTr (0,4% Triton X-100 dans PBS) et lavez les échantillons 3x, 5 min chacun, à TA sur un agitateur orbital.
- Remplacer PBSTr par une solution bloquante (PBSTr avec 10% de sérum bovin inactivé par la chaleur). Incuber de 2 h à O/N à 4 °C sur un agitateur orbital.
- Remplacer la solution bloquante par une solution de blocage contenant des anticorps primaires à la concentration souhaitée (pour les anticorps anti-GFP ou anti-VE-Cadhérine, utiliser une dilution de 1:1000). Incuber O/N sur un agitateur orbital à 4 °C.
- Après incubation O/N à 4 °C, incuber pendant 1,5 h à RT sur un agitateur orbital. Cette étape est très importante pour augmenter le rapport signal sur bruit.
- Retirer et conserver à 4 °C la solution d’anticorps primaire pour un maximum de trois expériences futures (ajouter l’azoture de sodium à une concentration finale de 0,02 % pour une meilleure conservation).
- Laver les embryons 3x avec PBSTr pendant 3 min chacun.
- Laver les embryons avec PBSTr 3x pendant 30 min chacun sur un agitateur orbital à 4 °C.
- Après le dernier lavage, ajouter 1 mL de solution bloquante contenant 1:1000 anticorps secondaire conjugué à la fluorescence contre l’espèce hôte de l’anticorps primaire. Ajouter également 1:3000 DAPI à la solution et incuber les embryons O/N sur un agitateur orbital à 4 °C.
- Après incubation O/N à 4 °C, incuber pendant 1,5 h à RT sur un agitateur orbital. Cette étape est très importante pour augmenter le rapport signal sur bruit.
- Laver les embryons 3x avec PBSTr pendant 3 min chacun.
- Laver les embryons avec PBSTr 3x-5x pendant 30 min chacun sur un agitateur orbital à RT.
3. Montage de l’AVC embryonnaire ou des OFT de souris
- Mettez les cœurs sur une boîte de Petri (35 mm) contenant du PBS.
- À l’aide d’un fil de tungstène et de fines pinces, isoler l’AVC ou l’OFT, et les couper longitudinalement26.
- Préparez des lamelles de couverture (22 mm x 22 mm), des lames (60 mm x 24 mm), des pinces, une pipette P200 avec les embouts appropriés, une serviette en papier et tout support de montage aqueux à base de glycérol pour la fluorescence, sans DAPI.
- En utilisant une approche similaire à celle de Xiao, C. et al.25, collez deux bandes de ruban adhésif sur une lame, séparées de 0,3 à 0,6 cm afin de créer un espace de pièce 3D qui permettra aux échantillons de conserver sa forme originale sans les écraser.
- Avec précaution et en utilisant le volume minimum de tampon, déposez les échantillons sur la lame entre les bandes à l’aide d’une pipette à pointe P200 coupée. Utilisez un microscope à dissection pour augmenter la précision.
- À l’aide de pinces fines, placer les échantillons avec l’endocarde vers le haut (myocarde vers le bas sur la lame).
- Retirez l’excès de PBS avec une serviette en papier (évitez de toucher l’échantillon), puis séchez les échantillons pendant 1-2 minutes à TA pour que les échantillons collent à la lame.
- Ajouter 40 μL de support de montage à base aqueuse sur le tissu.
- Placez le couvercle sur les deux morceaux de ruban adhésif et abaissez-le lentement sur le tissu à l’aide d’une aiguille ou d’une pince. Évitez de créer des bulles d’air.
- Scellez le bordereau à l’aide d’une goutte de vernis à ongles sur chaque sommet du bordereau.
- Une fois que le vernis à ongles est sec, nettoyez l’excès de support de montage sur les côtés de la lamelle de couverture à l’aide d’une serviette en papier absorbante. Évitez de déplacer le bordereau.
- Ajoutez du vernis à ongles le long des bords de la couvercle pour le sceller complètement, empêchant ainsi l’évaporation du support de montage.
- À l’aide d’un microscope confocal vertical ou inversé, prenez des images à 10x pour une vue générale et à 63x avec un zoom 3x pour des images détaillées.
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Representative Results
Les données générées à l’aide de ce protocole montrent qu’il est possible d’effectuer une imagerie faciale de l’endocarde de l’AVC. Le premier objectif était d’analyser la forme cellulaire de l’endocarde lors de la formation des valves à une résolution cellulaire (Figure 1). Afin de mettre en évidence les cellules endocardiques individuelles à E9.5, nous avons utilisé deux souches de souris transgéniques. (1) ROSAmT/mG est un allèle rapporteur Cre fluorescent bicolore (tdTomato/mT et EGFP/mG) dont la fluorescence est détectée au niveau de la membrane cellulaire. Sans activation médiée par Cre, le transgène exprime tdTomato (mT). Lors de l’activation médiée par Cre, l’expression de la tomate td est remplacée par l’expression de fluorescence EGFP (mG) dans des cellules spécifiques et des dérivés clonaux27. (2) La lignée de souris Cdh5CreERT2/+ exprime la CRE-recombinase inductible par le tamoxifène (CreERT2) sous la régulation du promoteur de la cadhérine endothéliale vasculaire (Cdh5), qui est exprimé dans l’endothélium vasculaire et l’endocarde aux stades embryonnaires28. Nous avons croisé un mâle et une femelle de chaque génotype pour obtenir des embryons porteurs des deux transgènes afin d’activer l’expression de la GFP dans les cellules individuelles de l’endocarde. Pour ce faire, nous avons inoculé de faibles doses de tamoxifène pour activer l’expression de CRE dans un nombre réduit de cellules. En conséquence, des cellules individuelles, ou des clones de quelques cellules, ont exprimé la GFP dans l’endocarde (Figure 1A). L’expression de la GFP (Figure 1A,B) en combinaison avec la localisation subcellulaire VE-Cadhérine (Figure 1C) est une approche efficace pour étudier la relation entre la dynamique AJ et la formation de filopodia dans les cellules pré-EMT puisque ces cellules développent des protubérances membranaires lorsque les AJ se dissolvent29. Les signaux PCP peuvent conférer une contractilité anisotrope aux AJ, produisant des forces cellulaires qui favorisent la morphogenèse polarisée dans l’épithélium30. Nous avons trouvé des différences dans l’intensité de la coloration VE-Cadhérine dans l’endocarde (Figure 2), indiquant que nous ne pouvons pas écarter la contractilité anisotrope dans l’endocarde embryonnaire de l’AVC aux stades prévalvulaires.
Le deuxième objectif était d’analyser la topologie plane de l’endocarde au cours du développement valvulaire (Figure 2). Afin de définir le nombre de cellules convergeant dans un seul sommet, nous avons coloré tout le cœur avec l’anticorps VE-Cadhérine à E8.5 et E9.5 (Figure 2A,B). D’autres molécules localisées aux contacts cellule-cellule de la cellule endocardique seraient également utiles à cette fin (par exemple, β-caténine). À E8.5, l’endocarde de l’AVC a tendance à avoir une organisation épithéliale stable, et nous n’avons pas pu détecter les sommets formés par plus de quatre cellules (Figure 2A,C). Plus tard, à E9.5, nous avons trouvé des sommets constitués de jusqu’à six cellules formant des structures en forme de rosette (Figure 2B, D), similaires à l’organisation cellulaire précédemment décrite dans l’épithélium subissant des réarrangements cellulaires actifs31, suggérant que l’endocarde AVC subit un réarrangement cellulaire actif pendant le développement de la valve.
Figure 1 : Analyse de la forme d’une cellule unique dans l’endocarde prévalvulaire. (A) CVA de l’embryon de souris E9.5 ouvert longitudinalement montrant des cellules GFP positives dispersées. (B) L’expression de la GFP dans des cellules individuelles définit la forme de la cellule à la résolution cellulaire. (C) La coloration en montage entier de VE-Cadhérine met en évidence les AJ. Les filopodia sont générées dans les domaines de la cellule qui ne localisent pas VE-Cadhérine (flèches violettes), et vice versa, VE-Cadhérine se localise dans les domaines de la cellule qui sont lisses et ne forment pas de filopodia (pointes de flèches bleues). v, ventral; d, dorsale. La barre d’échelle en A est de 100 μm; en B et C est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La topologie plane et l’anisotropie des protéines localisées planaires peuvent être définies dans les images faciales de l’endocarde au canal AV. La VE-Cadhérine est localisée au niveau des contacts cellule-cellule de l’endocarde. (A) E8.5 et (B) E9.5 AVC provenant d’embryons ont été ouverts longitudinalement. Les grossissements en (C) et (D) nous ont permis d’observer le nombre de cellules qui convergent dans un sommet. De plus, nous pouvons distinguer différentes intensités dans la coloration VE-Cadherin, indiquant que son emplacement dans l’AVC est anisotrope. La barre d’échelle en A et B est de 100 μm; en C et D est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’endocarde est une monocouche épithéliale qui recouvre toute la surface interne du tube cardiaque embryonnaire. Au cours du développement valvulaire, les cellules endocardiques des régions valvulaires potentielles subissent une EMT, de sorte que les cellules endocardiques transforment et réarrangent leur cytosquelette pour se délaminer de l’endocarde vers la gelée cardiaque. Nous et d’autres avons obtenu des données pertinentes sur le développement valvulaire chez les embryons de souris en analysant des sections transversales de cœurs embryonnaires E8.5 et E9.5, où l’endocarde est représenté comme une rangée de cellules 6,8,24,32. Cette approche a permis d’analyser l’expression des voies de signalisation et d’autres molécules impliquées dans le développement valvulaire, mais il n’a pas été possible d’analyser les aspects spatiaux de l’endocarde prévalvulaire.
Les explants AVC ou OFT ont été principalement utilisés pour étudier la transformation de la CE sur un gel de collagène 3D. Les explants sont utiles pour la quantification EMT, l’analyse de la capacité de transformation ou le test de médicaments après quelques jours en culture 6,7,11,33. Ces expériences ex vivo permettent également l’expansion de l’endocarde sur le gel de collagène en tant que monocouche, mais les conditions environnementales dans lesquelles les explants cardiaques ex vivo sont cultivés diffèrent des conditions in utero. Par exemple, le flux sanguin unidirectionnel est essentiel au bon développement valvulaire34,35 et n’est obtenu que dans les explants in utero, et non ex vivo.
Cette nouvelle approche nous permet d’observer l’endocarde valvulaire intact en face au début du développement de la valve sans aucune manipulation environnementale. Il permet l’analyse de la distribution cellulaire de l’endocarde valvulaire, ainsi que l’analyse de la forme unicellulaire avant et pendant l’EMT dans des conditions in utero . Nous pouvons également observer et analyser l’intensité et l’organisation des contacts cellule-cellule et la distribution subcellulaire des molécules pertinentes pendant l’EMT. Cette technique offre également la possibilité d’analyser les structures subcellulaires de l’endocarde, l’activation des voies de signalisation en utilisant des gènes rapporteurs, l’effet que l’inactivation des gènes peut avoir sur le comportement cellulaire et comment elle peut affecter les cellules voisines de type sauvage.
Pour obtenir des échantillons de haute qualité, il est important d’être très prudent lors de leur manipulation, car les impuretés (p. ex. microfibres) qui adhèrent au tissu peuvent entraîner des artefacts lors de la capture d’images. De plus, comme il s’agit de très petits échantillons, le risque de rupture est élevé, il faut donc laver le tissu (étape 1. et étape 2.) dans des agitateurs lents. Lors du changement de média avec des pipettes, nous recommandons de couper l’embout pour éviter que le tissu ne s’effondre lorsqu’il traverse l’embout en cas d’absorption accidentelle. Pour devenir un expert de cette technique, une courbe d’apprentissage est nécessaire, qui sera plus ou moins longue en fonction de l’expérience antérieure du chercheur en micromanipulation.
Le choix du bon fixateur et du bon moment de fixation peut être important dans le cas de l’utilisation de transgènes qui expriment des protéines fluorescentes. La structure anatomique n’est pas affectée par différents fixateurs tels que l’éthanol 70%, le méthanol, le PFA 4% ou le formol 10%.
Pour contrer la coloration des noyaux, nous recommandons l’incubation des échantillons avec DAPI car la pénétration est beaucoup plus efficace que l’utilisation de supports de montage avec DAPI.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par les subventions PID2019-104776RB-I00 et CB16/11/00399 (CV CIBER) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 à J. L. P. J.G.-B. a été financé par Programa de Atracción de Talento de la Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. a été financé par Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Nous remercions l’Unité CNIC de Microscopie et d’Imagerie Dynamique, CNIC, ICTS-ReDib, cofinancée par MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et FEDER « A way to make Europe » (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Nous remercions également A. Galicia et L. Méndez pour l’élevage de souris. Le coût de cette publication a été financé en partie par des fonds du Fonds européen de développement régional. Le CNIC est soutenu par l’ISCIII, le MCIN et la Fondation Pro CNIC et est un centre d’excellence Severo Ochoa (subvention CEX2020-001041-S) financé par MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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