Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

Summary

Escherichia coli verursacht Sepsis bei Neugeborenen, die die Bakterien um den Zeitpunkt der Geburt aufnehmen. Der Prozess, der an der Fähigkeit von E. coli beteiligt ist, vom Darmtrakt in den Blutkreislauf zu gelangen, ist kaum verstanden. Dieses In-vitro-Modell bewertet die Fähigkeit von E. coli-Stämmen, durch die Darmepithelzellen zu wandern.

Abstract

Neugeborene nehmen mütterliche E. coli-Stämme auf, die ihren Darmtrakt um den Zeitpunkt der Geburt besiedeln. E. coli-Stämme mit der Fähigkeit, über den Darm zu translozieren, dringen in den Blutkreislauf des Neugeborenen ein und verursachen lebensbedrohliche Bakteriämie. Die hier vorgestellte Methodik verwendet polarisierte intestinale Epithelzellen, die auf semipermeablen Einsätzen gezüchtet wurden, um die Transzytose von neonatalen E. coli-Bakteriämie-Isolaten in vitro zu beurteilen. Diese Methode nutzt die etablierte T84-Darmzelllinie, die die Fähigkeit hat, zu Konfluenz zu wachsen und enge Verbindungen und Desmosomen zu bilden. Nach Erreichen der Konfluenz entwickeln reife T84-Monoschichten einen transepithelialen Widerstand (TEER), der mit einem Voltmeter quantifiziert werden kann. Die TEER-Werte korrelieren umgekehrt mit der parazellulären Permeabilität extrazellulärer Komponenten, einschließlich Bakterien, über die intestinale Monoschicht. Die transzelluläre Passage von Bakterien (Transzytose) hingegen verändert die TEER-Messungen nicht notwendigerweise. In diesem Modell wird die bakterielle Passage durch die intestinale Monoschicht bis zu 6 h nach der Infektion quantifiziert, und wiederholte Messungen von TEER werden durchgeführt, um die parazelluläre Permeabilität zu überwachen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode den Einsatz von Techniken wie der Immunfärbung, um die strukturellen Veränderungen in Tight Junctions und anderen Zell-zu-Zell-Adhäsionsproteinen während der bakteriellen Transzytose über das polarisierte Epithel zu untersuchen. Die Verwendung dieses Modells trägt zur Charakterisierung der Mechanismen bei, durch die neonatale E. coli durch das Darmepithel transzytieren, um Bakteriämie zu erzeugen.

Introduction

Escherichia coli ist die häufigste Ursache für eine früh einsetzende Sepsis bei Neugeborenen ^1,2,3. Die Sterblichkeitsrate der neonatalen E. coli-Bakteriämie kann 40% erreichen, und Meningitis ist eine mögliche Komplikation, die mit schweren neurologischen Entwicklungsstörungen einhergeht². Die Aufnahme von mütterlichen E. coli-Stämmen durch das Neugeborene kann zu neonataler Bakteriämie führen; Dieser Prozess wurde in Tiermodellen^{repliziert 2,4}. Einmal eingenommen, wandern pathogene Bakterien aus dem neonatalen Darmlumen über die Darmbarriere und gelangen in den Blutkreislauf, was zu einer Sepsis führt. Neonatale invasive E. coli-Stämme, die Bakteriämien produzieren, unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, in Darmepithelzellen einzudringen ^1,5. Ihre Fähigkeit, das Darmepithel nach der Invasion zu transzytieren, ist jedoch nicht vollständig charakterisiert.

Dieses intestinale Transzytosemodell ist eine nützliche In-vitro-Methode, um die bakterielle Passage durch das Darmepithel zu emulieren. Das übergeordnete Ziel der in diesem Manuskript vorgestellten Methoden ist es, die Fähigkeit von neonatalen E. coli-Isolaten zu vergleichen, das Darmepithel zu transzytieren. Das hier beschriebene Modell verwendet T84-Zellen, die immortalisierte humane intestinale Adenokarzinomzellen ^6,7 sind. T84-Zellen werden auf einer semipermeablen Membran mit zwei getrennten Kompartimenten zum Zusammenfluss gezüchtet. Der Grund für die Anwendung dieser Technik ist, dass diese Darmzellen, wie in vivo geschehen, polarisieren und reife Tight Junctions entwickeln ^6,8. Die Seite, die mit der Membran in Kontakt kommt, wird zur basalen Seite. Die gegenüberliegende Seite der Zellen wird zur apikalen Seite und ähnelt dem Darmlumen, wo aufgenommene Krankheitserreger haften und eindringen. Die Transwell-Membran ist durchlässig für Bakterien, aber die polarisierten Darmzellen bilden enge Verbindungen, die die bakterielle parazelluläre Bewegung beeinträchtigen⁹. Somit bietet diese Methode den Vorteil einer kontrollierten In-vitro-Umgebung, in der eine menschliche Zelllinie verwendet wird, um den Prozess der bakteriellen Transzytose, einschließlich des transzellulären Weges, zu untersuchen. Während es andere Methoden gibt, um die Transzytose von Bakterien über das Darmepithel zu untersuchen, bietet die hier vorgestellte Transwell-Methode eine größere Leichtigkeit und Zugänglichkeit. Es stehen alternative Techniken zur Verfügung, z. B. unter Verwendung von Ex-vivo-Proben, die in Ussing-Kammersystemen eingerichtet wurden. Sie verwenden jedoch Gewebeproben, die möglicherweise nicht leicht zugänglich sind, insbesondere wenn die Forschung beabsichtigt, die menschliche Physiologie zu untersuchen¹⁰. Intestinale Organoide stellen ein weiteres Beispiel für eine In-vitro-Alternative zur Untersuchung von Wirt-Bakterien-Interaktionen dar¹¹. Während organoide Monoschichten auch im Transwell-System verwendet werden können, um bakterielle Transzytose zu untersuchen, erfordern sie die Isolierung und das Wachstum von Stammzellen und die Verwendung spezifischer Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung zu induzieren¹². Daher ist ihre Verwendung zeitaufwendiger und mit höheren Kosten verbunden als die in diesem Manuskript beschriebene Transwell-Methode.

Die Beurteilung der bakteriellen Passage durch das Darmepithel mit diesem In-vitro-Transwell-System wurde erfolgreich für verschiedene Krankheitserreger durchgeführt. Diese Studien haben den Nutzen des Transwell-Systems unter Verwendung von T84-Zellen gezeigt, um die Transzytose von Bakterien über das polarisierte Darmepithel zu charakterisieren^13,14,15. Die Anwendung dieser Transwell-Methode zum Vergleich der Transzytosefähigkeit von Bakteriämie erzeugenden neonatalen E. coli-Stämmen wurde jedoch nicht detailliert beschrieben. Dieses Manuskript bietet anderen Forschern ein Standard-Transwell-Protokoll, das zuverlässig und einfach zu bedienen ist und keine zu teuren Ressourcen erfordert.

Um die Fähigkeit neonataler invasiver E. coli-Stämme zur Transzytose des Darmepithels zu vergleichen, kann die apikale Seite der intestinalen Epithelmonoschicht mit einer bekannten Anzahl von Bakterienzellen infiziert werden. Nach der Inkubation kann das Medium auf der basalen Seite des Epithels gesammelt und die Bakterien quantifiziert werden, um die Menge der bakteriellen Transzytose im Laufe der Zeit zu bestimmen. In diesem Manuskript werden die vorgestellten Methoden verwendet, um die Transzytosefähigkeit von klinischen E. coli-Stämmen von Neugeborenen zu untersuchen, die von Neugeborenen mit Bakteriämie hospitalisiert wurden. Die Einschlusskriterien für die Auswahl dieser neonatalen klinischen Isolate für Transzytosestudien wurden bereits veröffentlicht ^1,2,16. Wenn diese Methode mit verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt wird, können ihre Transzytosefähigkeiten verglichen werden. Durch diesen Prozess liefert das intestinale Transzytosemodell wertvolle Daten zur Charakterisierung der Virulenzfaktoren von E. coli, die zu dem mehrstufigen Prozess beitragen, der in der Entwicklung einer neonatalen Bakteriämie gipfelt.

Protocol

HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen der T84-Zellen, Bakterien, Platten und Reagenzien in einer Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie separate Bereiche und Inkubatoren für alle Arbeiten mit sterilen T84-Zellen, infizierten T84-Zellen und E. coli. Die klinischen E. coli-Isolate, die mit den hier beschriebenen Methoden getestet wurden, wurden nach den Richtlinien des Institutional Review Board an unserer Institution 1,16</s…

Representative Results

Abbildung 1: T84 TEER im Zeitverlauf. Wenn die T84-Zellschicht auf dem Einsatz reift, steigt der elektrische Widerstand der Monoschicht. Bei einem TEER von mindestens 1.000 Ω·cm2 ist die Zellschicht ausreichend entwickelt, um den parazellulären Bakterientransport zu verringern und die Messung des primär transzellulären Bakterientrans…

Discussion

Diese Methode leitet sich von Techniken ab, die in der Gastroenterologie und bei Infektionskrankheiten^{verwendet werden 20}. In-vitro-Modelle der intestinalen Epithelbarriere wurden verwendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die die luminalen Gehalte mit dieser relevanten Komponente der angeborenen Immunität interagieren ^6,8. Die Wirt-Pathogen-Interaktionen von invasiven neonatalen E. coli wurden auch separat durch …

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282