Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli
Summary
Escherichia coli causa sepsis en neonatos que ingieren la bacteria alrededor del momento del nacimiento. El proceso involucrado en la capacidad de E. coli para viajar desde el tracto entérico al torrente sanguíneo es poco conocido. Este modelo in vitro evalúa la capacidad de las cepas de E. coli para viajar a través de las células epiteliales intestinales.
Abstract
Los recién nacidos ingieren cepas maternas de E. coli que colonizan su tracto intestinal alrededor del momento del parto. Las cepas de E. coli con la capacidad de translocarse a través del intestino invaden el torrente sanguíneo del recién nacido, causando bacteriemia potencialmente mortal. La metodología presentada aquí utiliza células epiteliales intestinales polarizadas cultivadas en insertos semipermeables para evaluar la transcitosis de aislados de bacteriemia neonatal por E. coli in vitro. Este método utiliza la línea celular intestinal T84 establecida que tiene la capacidad de crecer para confluir y formar uniones estrechas y desmosomas. Después de alcanzar la confluencia, las monocapas T84 maduras desarrollan resistencia transepitelial (TEER), que se puede cuantificar utilizando un voltímetro. Los valores de TEER están inversamente correlacionados con la permeabilidad paracelular de los componentes extracelulares, incluidas las bacterias, a través de la monocapa intestinal. El paso transcelular de bacterias (transcitosis), por otro lado, no necesariamente altera las mediciones TEER. En este modelo, el paso bacteriano a través de la monocapa intestinal se cuantifica hasta 6 h después de la infección, y se realizan mediciones repetidas de TEER para controlar la permeabilidad paracelular. Además, este método facilita el uso de técnicas como la inmunotinción para estudiar los cambios estructurales en las uniones estrechas y otras proteínas de adhesión de célula a célula durante la transcitosis bacteriana a través del epitelio polarizado. El uso de este modelo contribuye a la caracterización de los mecanismos por los cuales E. coli neonatal se transcita a través del epitelio intestinal para producir bacteriemia.
Introduction
Escherichia coli es la causa más común de sepsis de inicio temprano en recién nacidos 1,2,3. La tasa de mortalidad de la bacteriemia neonatal por E. coli puede alcanzar el 40%, y la meningitis es una posible complicación asociada a discapacidades graves del desarrollo neurológico2. La ingestión de cepas maternas de E. coli por el recién nacido puede producir bacteriemia neonatal; Este proceso ha sido replicado en modelos animales 2,4. Una vez ingeridas, las bacterias patógenas viajan desde la luz intestinal neonatal a través de la barrera intestinal y entran en el torrente sanguíneo, causando septicemia. Las cepas neonatales invasivas de E. coli que producen bacteriemia varían en su capacidad para invadir las células epitelialesintestinales 1,5. Sin embargo, su capacidad para transcitar el epitelio intestinal después de la invasión no ha sido completamente caracterizada.
Este modelo de transcitosis intestinal es un método in vitro útil para emular el paso bacteriano a través del epitelio intestinal. El objetivo general de los métodos presentados en este manuscrito es comparar la capacidad de los aislados neonatales de E. coli para transcitar el epitelio intestinal. El modelo descrito aquí utiliza células T84, que son células de adenocarcinoma intestinal humano inmortalizadas 6,7. Las células T84 se cultivan para confluir en una membrana semipermeable con dos compartimentos separados. La justificación para utilizar esta técnica es que, como sucede in vivo, estas células intestinales se polarizan y desarrollan uniones estrechas maduras 6,8. El lado en contacto con la membrana se convierte en el lado basal. El lado opuesto de las células se convierte en el lado apical, parecido a la luz intestinal donde los patógenos ingeridos se adhieren e invaden. La membrana transwell es permeable a las bacterias, pero las células intestinales polarizadas forman uniones estrechas, que perjudican el movimiento paracelular bacteriano9. Por lo tanto, este método proporciona la ventaja de un entorno in vitro controlado que utiliza una línea celular humana para estudiar el proceso de transcitosis bacteriana, incluida la ruta transcelular. Mientras que existen otros métodos para investigar la transcitosis de bacterias a través del epitelio intestinal, el método transwell presentado aquí proporciona una mayor facilidad y accesibilidad. Se dispone de técnicas alternativas, como las que utilizan muestras ex vivo instaladas en sistemas de cámaras Ussing. Sin embargo, utilizan muestras de tejido que pueden no ser fácilmente accesibles, particularmente si la investigación tiene la intención de estudiar la fisiología humana10. Los organoides intestinales representan otro ejemplo de una alternativa in vitro para estudiar las interacciones huésped-bacteria11. Mientras que las monocapas organoides también pueden ser utilizadas en el sistema transwell para estudiar la transcitosis bacteriana, requieren el aislamiento y crecimiento de células madre y el uso de factores de crecimiento específicos para inducir la diferenciación12. Por lo tanto, su uso requiere más tiempo y se asocia con mayores costos en comparación con el método transwell descrito en este manuscrito.
La evaluación del paso bacteriano a través del epitelio intestinal utilizando este sistema de transwell in vitro se ha realizado con éxito para varios patógenos. Estos estudios han demostrado la utilidad del sistema transwell utilizando células T84 para caracterizar la transcitosis de bacterias a través del epitelio intestinal polarizado13,14,15. Sin embargo, la aplicación de este método transwell para comparar la capacidad de transcitosis de cepas neonatales de E. coli productoras de bacteriemia no se ha descrito en detalle. Este manuscrito proporciona a otros investigadores un protocolo estándar de transwell que es confiable y fácil de usar y no requiere recursos demasiado caros.
Para comparar la capacidad de las cepas neonatales invasivas de E. coli para transcitar el epitelio intestinal, el lado apical de la monocapa epitelial intestinal puede infectarse con un número conocido de células bacterianas. Después de la incubación, se puede recolectar el medio en el lado basal del epitelio y cuantificar las bacterias para determinar la cantidad de transcitosis bacteriana a lo largo del tiempo. En este manuscrito, los métodos presentados se utilizan para estudiar la capacidad de transcitosis de cepas clínicas neonatales de E. coli recuperadas de recién nacidos hospitalizados con bacteriemia. Los criterios de inclusión para la selección de estos aislados clínicos neonatales para estudios de transcitosis han sido publicados previamente 1,2,16. Cuando este método se realiza utilizando diferentes cepas de E. coli, se pueden comparar sus capacidades de transcitosis. A través de este proceso, el modelo de transcitosis intestinal proporciona datos valiosos para caracterizar los factores de virulencia de E. coli que contribuyen al proceso de múltiples pasos que culmina en el desarrollo de bacteriemia neonatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método se deriva de técnicas utilizadas en gastroenterología y enfermedades infecciosas20. Se han utilizado modelos in vitro de la barrera epitelial intestinal para dilucidar los mecanismos por los cuales el contenido luminal interactúa con este componente relevante de la inmunidad innata 6,8. Las interacciones huésped-patógeno de E. coli neonatal invasiva también se han caracterizado por separado a través de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca estudiantil Sarah Morrison emitida por la Escuela de Medicina de la Universidad de Missouri-Kansas City a A.I.
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
