新生児大腸 菌 分離株の腸管トランスサイトーシスの評価
Summary
大腸菌は、出生前後に細菌を摂取した新生児に敗血症を引き起こします。大腸菌が腸管から血流に移動する能力に関与するプロセスは、よく理解されていません。このin vitroモデルは、大腸菌株が腸上皮細胞を通過する能力を評価します。
Abstract
新生児は、出産前後に腸管にコロニーを形成する母体の大腸菌株を摂取します。腸内を移動する能力を持つ大腸菌株は、新生児の血流に侵入し、生命を脅かす菌血症を引き起こします。ここで紹介する方法論は、半透性インサート上で増殖させた分極腸上皮細胞を利用して、in vitroで新生児大腸菌血症分離株のトランスサイトーシスを評価します。この方法は、コンフルエントに成長し、タイトジャンクションとデスモソームを形成する能力を有する確立されたT84腸細胞株を使用します。コンフルエントに達した後、成熟したT84単層は経上皮抵抗(TEER)を発症し、電圧計を使用して定量化できます。TEER値は、腸単層を横切る細菌を含む細胞外成分の傍細胞透過性と逆相関しています。一方、細菌の経細胞通過(トランスサイトーシス)は、必ずしもTEER測定値を変化させるわけではありません。このモデルでは、腸単層を横切る細菌の通過が感染後最大6時間定量化され、傍細胞透過性を監視するためにTEERの繰り返し測定が行われます。さらに、この方法は、分極上皮を横切る細菌トランスサイトーシス中のタイトジャンクションおよび他の細胞間接着タンパク質の構造変化を研究するための免疫染色などの技術の使用を容易にします。このモデルの使用は、新生児大腸菌が腸上皮を横切って菌血症を引き起こすメカニズムの特性評価に貢献します。
Introduction
大腸菌は、新生児の早期発症型敗血症の最も一般的な原因です1、2、3。新生児大腸菌血症の死亡率は40%に達する可能性があり、髄膜炎は重度の神経発達障害に関連する可能性のある合併症です2。新生児による母体の大腸菌株の摂取は、新生児菌血症を引き起こす可能性があります。このプロセスは、動物モデル2、4で再現されています。摂取されると、病原菌は新生児の腸管腔から腸関門を越えて血流に入り、敗血症を引き起こします。菌血症を産生する新生児侵襲性大腸菌株は、腸上皮細胞に侵入する能力が異なる1,5。しかしながら、浸潤後に腸上皮をトランスサイトーゼするそれらの能力は完全には特徴付けられていない。
この腸管トランスサイトーシスモデルは、腸上皮を横切る細菌の通過をエミュレートするための有用なin vitro法である。この原稿で提示された方法の全体的な目標は、腸上皮をトランスサイトーゼする新生児大腸菌分離物の能力を比較することです。ここで説明するモデルは、不死化ヒト腸腺癌細胞であるT84細胞を利用する6,7。T84細胞は、2つの別々のコンパートメントを有する半透膜上でコンフルエントに増殖する。この技術を使用する理論的根拠は、in vivoで起こるように、これらの腸細胞が分極し、成熟したタイトジャンクションを発達させることです6,8。膜と接触する側が基底側となる。細胞の反対側は頂端側になり、摂取された病原体が付着して侵入する腸管腔に似ています。トランスウェル膜は細菌に対して透過性ですが、分極した腸細胞はタイトジャンクションを形成し、細菌の傍細胞運動を損ないます9。したがって、この方法は、経細胞経路を含む細菌性トランスサイトーシスの過程を研究するためにヒト細胞株を利用する制御されたインビトロ環境の利点を提供する。腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを調査するための他の方法が存在するが、ここで紹介するトランスウェル法は、より容易でアクセスしやすい方法を提供する。Ussingチャンバーシステムに設置されたex vivoサンプルを利用する技術などの代替技術が利用可能です。ただし、特に研究が人間の生理学を研究することを意図している場合は、簡単にアクセスできない可能性のある組織標本を利用します10。腸管オルガノイドは、宿主-細菌相互作用を研究するためのin vitro代替物の別の例を表しています11。オルガノイド単分子膜は、細菌のトランスサイトーシスを研究するためにトランスウェルシステムでも使用できますが、幹細胞の単離と増殖、および分化を誘導するための特定の成長因子の使用が必要です12。したがって、それらの使用は、この原稿に記載されているトランスウェル法と比較して、より時間がかかり、より大きなコストを伴う。
このin vitroトランスウェルシステムを用いた腸上皮を横切る細菌の通過の評価は、様々な病原体に対して成功裏に行われている。これらの研究は、分極した腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを特徴付けるためにT84細胞を使用するトランスウェルシステムの有用性を示しています13、14、15。しかしながら、菌血症産生新生児大腸菌株のトランスサイトーシス能を比較するためのこのトランスウェル法の適用は詳細に説明されていない。この原稿は、信頼性が高く使いやすく、高すぎるリソースを必要としない標準的なTranswellプロトコルを他の研究者に提供します。
腸上皮をトランスサイトーゼする新生児侵襲性 大腸菌 株の能力を比較するために、腸上皮単層の頂端側に、既知の数の細菌細胞を感染させることができる。インキュベーション後、上皮の基底側の培地を回収し、細菌を定量して、細菌トランスサイトーシスの量を経時的に決定することができます。この原稿では、提示された方法を利用して、菌血症で入院した新生児から回収された新生児 大腸菌 臨床株のトランスサイトーシス能力を研究しています。トランスサイトーシス研究のためのこれらの新生児臨床分離株の選択のための選択基準は、以前に公開されている1、2、16。この方法が異なる 大腸菌 株を用いて行われる場合、それらのトランスサイトーシス能力を比較することができる。このプロセスを通じて、腸管トランスサイトーシスモデルは、新生児菌血症の発症に至る多段階のプロセスに寄与する 大腸菌 の病原性因子を特徴付けるための貴重なデータを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、消化器病学および感染症20で使用される技術に由来します。腸管上皮バリアのin vitroモデルは、管腔内容物が自然免疫のこの関連成分と相互作用するメカニズムを解明するために使用されています6,8。侵襲性新生児大腸菌の宿主と病原体の相互作用も、遺伝子分析、抗菌薬耐性の研究、および免疫学的手?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ミズーリ大学カンザスシティ医学部がAIに発行したサラモリソン学生助成金によってサポートされました。
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
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