Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Summary

Escherichia coli causa sepse em neonatos que ingerem a bactéria na época do nascimento. O processo envolvido na capacidade da E. coli de viajar do trato entérico para a corrente sanguínea é pouco compreendido. Este modelo in vitro avalia a capacidade das cepas de E. coli de viajar através das células epiteliais intestinais.

Abstract

Os recém-nascidos ingerem cepas maternas de E. coli que colonizam seu trato intestinal na época do parto. Cepas de E. coli com a capacidade de se deslocar através do intestino invadem a corrente sanguínea do recém-nascido, causando bacteremia com risco de vida. A metodologia aqui apresentada utiliza células epiteliais intestinais polarizadas cultivadas em pastilhas semipermeáveis para avaliar a transcitose de isolados de bacteremia neonatal de E. coli in vitro. Este método usa a linhagem celular intestinal T84 estabelecida que tem a capacidade de crescer até a confluência e formar junções apertadas e desmossomos. Após atingir a confluência, as monocamadas maduras de T84 desenvolvem resistência transepitelial (TEER), que pode ser quantificada usando um voltímetro. Os valores de TEER estão inversamente correlacionados com a permeabilidade paracelular de componentes extracelulares, incluindo bactérias, através da monocamada intestinal. A passagem transcelular de bactérias (transcitose), por outro lado, não altera necessariamente as medidas do TEER. Neste modelo, a passagem bacteriana através da monocamada intestinal é quantificada por até 6 h pós-infecção, e medições repetidas de TEER são feitas para monitorar a permeabilidade paracelular. Além disso, esse método facilita o uso de técnicas como a imunocoloração para estudar as mudanças estruturais em junções apertadas e outras proteínas de adesão célula a célula durante a transcitose bacteriana através do epitélio polarizado. O uso deste modelo contribui para a caracterização dos mecanismos pelos quais a E. coli neonatal transcita através do epitélio intestinal para produzir bacteremia.

Introduction

Escherichia coli é a causa mais comum de sepse de início precoce em recém-nascidos ^1,2,3. A taxa de mortalidade da bacteremia neonatal por E. coli pode chegar a 40%, sendo a meningite uma possível complicação associada a graves incapacidades de neurodesenvolvimento². A ingestão de cepas maternas de E. coli pelo recém-nascido pode produzir bacteremia neonatal; esse processo tem sido replicado em modelos animais ^2,4. Uma vez ingeridas, as bactérias patogênicas viajam do lúmen intestinal neonatal através da barreira intestinal e entram na corrente sanguínea, causando septicemia. Cepas neonatais invasivas de E. coli que produzem bacteremia variam em sua capacidade de invadir células epiteliais intestinais ^1,5. No entanto, sua capacidade de transcitar o epitélio intestinal após a invasão não foi completamente caracterizada.

Este modelo de transcitose intestinal é um método in vitro útil para emular a passagem bacteriana através do epitélio intestinal. O objetivo geral dos métodos apresentados neste manuscrito é comparar a capacidade de isolados neonatais de E. coli de transcitose o epitélio intestinal. O modelo aqui descrito utiliza células T84, que são células imortalizadas de adenocarcinoma intestinal humano ^6,7. As células T84 são cultivadas até a confluência em uma membrana semipermeável com dois compartimentos separados. A justificativa para o uso dessa técnica é que, como acontece in vivo, essas células intestinais polarizam e desenvolvem junções apertadas maduras ^6,8. O lado em contato com a membrana torna-se o lado basal. O lado oposto das células torna-se o lado apical, assemelhando-se ao lúmen intestinal, onde os patógenos ingeridos aderem e invadem. A membrana transwell é permeável a bactérias, mas as células intestinais polarizadas formam junções apertadas, o que prejudica o movimento paracelular bacteriano⁹. Assim, este método proporciona a vantagem de um ambiente controlado in vitro utilizando uma linhagem celular humana para estudar o processo de transcitose bacteriana, incluindo a via transcelular. Enquanto outros métodos existem para investigar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal, o método transwell apresentado aqui fornece maior facilidade e acessibilidade. Técnicas alternativas, como as que utilizam amostras ex vivo configuradas em sistemas de câmara Ussing, estão disponíveis. No entanto, utilizam espécimes de tecido que podem não ser facilmente acessíveis, principalmente se a pesquisa pretende estudar a fisiologia humana¹⁰. Os organoides intestinais representam outro exemplo de alternativa in vitro para o estudo das interações hospedeiro-bactéria¹¹. Embora as monocamadas organoides também possam ser usadas no sistema transwell para estudar a transcitose bacteriana, elas requerem o isolamento e o crescimento de células-tronco e o uso de fatores de crescimento específicos para induzir a diferenciação¹². Assim, seu uso é mais demorado e associado a maiores custos em comparação com o método transwell descrito neste manuscrito.

A avaliação da passagem bacteriana através do epitélio intestinal usando este sistema de transwell in vitro tem sido realizada com sucesso para vários patógenos. Esses estudos têm demonstrado a utilidade do sistema transwell utilizando células T84 para caracterizar a transcitose de bactérias através do epitélio intestinal polarizado^13,14,15. No entanto, a aplicação deste método transwell para comparar a capacidade de transcitose de cepas neonatais de E. coli produtoras de bacteremia não foi descrita em detalhes. Este manuscrito fornece a outros pesquisadores um protocolo de transwell padrão que é confiável e fácil de usar e não requer recursos que são muito caros.

Para comparar a capacidade de cepas neonatais invasivas de E. coli de transcitar o epitélio intestinal, o lado apical da monocamada epitelial intestinal pode ser infectado com um número conhecido de células bacterianas. Após a incubação, o meio no lado basal do epitélio pode ser coletado e as bactérias quantificadas para determinar a quantidade de transcitose bacteriana ao longo do tempo. Neste manuscrito, os métodos apresentados são utilizados para estudar a capacidade de transcitose de cepas clínicas neonatais de E. coli recuperadas de recém-nascidos hospitalizados com bacteremia. Os critérios de inclusão para a seleção desses isolados clínicos neonatais para estudos de transcitose já foram publicados anteriormente ^1,2,16. Quando este método é realizado usando diferentes cepas de E. coli, suas habilidades de transcitose podem ser comparadas. Através deste processo, o modelo de transcitose intestinal fornece dados valiosos para caracterizar os fatores de virulência de E. coli que contribuem para o processo multipasso que culmina no desenvolvimento da bacteremia neonatal.

Protocol

NOTA: Execute todas as manipulações das células, bactérias, placas e reagentes T84 em um gabinete de segurança de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) para evitar a contaminação. Use áreas separadas e incubadoras para todo o trabalho envolvendo células T84 estéreis, células T84 infectadas e E. coli. Os isolados clínicos de E. coli testados com os métodos aqui descritos foram obtidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa de nossa instituição 1,16<sup class="xref"…

Representative Results

Figura 1: T84 TEER ao longo do tempo. À medida que a camada de células T84 amadurece na pastilha, a resistência elétrica da monocamada aumenta. Em um TEER de pelo menos 1.000 Ω·cm2, a camada celular está suficientemente desenvolvida para diminuir o transporte bacteriano paracelular e permitir a medição do trânsito bacteriano pri…

Discussion

Esse método é derivado de técnicas utilizadas em gastroenterologia e doenças infecciosas²⁰. Modelos in vitro da barreira epitelial intestinal têm sido utilizados para elucidar os mecanismos pelos quais o conteúdo luminal interage com esse componente relevante da imunidade inata ^6,8. As interações hospedeiro-patógeno de E. coli neonatal invasiva também têm sido caracterizadas separadamente por meio de análises …

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282