نظام تحليل الخلايا الهجينة لتقييم التغيرات الهيكلية والمقلصة لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لتقييم مخاطر القلب قبل السريرية
Summary
يعد تحليل التغيرات في وظيفة الانقباض والسلامة الخلوية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC ذا أهمية كبيرة لتطوير الأدوية غير السريرية. يعالج نظام تحليل الخلايا الهجين المكون من 96 بئرا كلا المعلمتين في الوقت الفعلي وبطريقة فسيولوجية للحصول على نتائج موثوقة وذات صلة بالإنسان ، وهي ضرورية للانتقال الآمن إلى المراحل السريرية.
Abstract
يعد تقييم انقباض القلب ذا أهمية كبيرة لتطوير علاجات جديدة وانتقالها الآمن إلى المراحل السريرية. في حين أن الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) تبشر بأن تكون بمثابة نموذج ذي صلة بالإنسان في المراحل قبل السريرية لاكتشاف الأدوية وسلامة الصيدلة ، إلا أن نضجها لا يزال مثيرا للجدل في المجتمع العلمي وقيد التطوير المستمر. نقدم تقنية الانقباض الهجين والمعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP) ، مما يضيف ميزات مهمة مؤيدة للنضج إلى منصة 96 بئرا متوافقة مع معايير الصناعة.
يراقب نظام المعاوقة / EFP الوظائف الخلوية في الوقت الفعلي. إلى جانب معدل ضربات الخلايا المقلصة ، تكتشف قراءات التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية التغيرات المورفولوجية التي يسببها المركب مثل كثافة الخلية وسلامة الطبقة الخلوية الأحادية. في المكون الآخر لنظام تحليل الخلايا الهجينة ، يتم استزراع الخلايا على أغشية متوافقة حيويا تحاكي البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب الحقيقية. تدعم هذه البيئة الفسيولوجية نضوج hiPSC-CMs في المختبر ، مما يؤدي إلى استجابات انقباضية تشبه البالغين بما في ذلك التأثيرات المؤثرة في التقلص العضلي الإيجابية بعد العلاج بالإيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil. كما تكشف معلمات مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ومدة النبض عن تأثيرات المصب للمركبات ذات التأثير على الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ومعالجة الكالسيوم.
يوفر النظام الهجين الأداة المثالية لتحليل الخلايا الشامل ، مما يسمح بتقييم مخاطر القلب قبل السريرية بما يتجاوز المنظورات الحالية للمقايسات القائمة على الخلايا ذات الصلة بالإنسان.
Introduction
أحد الأهداف الرئيسية لتطوير الأدوية الحديثة هو تحسين معدل نجاح العلاجات الجديدة في خط أنابيب اكتشاف الأدوية. غالبا ما تكشف الاختبارات الدوائية الآمنة لهذه الأدوية الجديدة عن تفاعلات دوائية ضارة على نظام القلب والأوعية الدموية الذي يمثل ما يقرب من ربع معدل استنزاف الدواء في المراحل قبل السريرية1. يلعب تطوير ودمج منهجيات النهج الجديدة (NAMs) دورا رئيسيا في تحديث التقييم قبل السريري ، ولا سيما أجهزة البطارية الأساسية مثل القلب. نظرا لأن هذه المنهجيات هي نهج خالية من الحيوانات ، فإن استخدام نماذج الخلايا البشرية مثل خلايا عضلة القلب (CMs) من أصل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) أصبح العمود الفقري على مدار العقد الماضي للتقييم الحديث للقضايا الدوائية والسميةللسلامة 2. أنظمة الفحص المستخدمة على نطاق واسع لمثل هذه التحقيقات هي مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) والنهج التجريبية القائمة على الصبغة الحساسة للجهد3.
ومع ذلك ، فإن عدم النضج الظاهري والوظيفي المزعوم لهذا النوع من الخلايا يضع عقبات في طريق نموذج الخلية المثالي القائم على الإنسان ، مع إمكانية تقليل الفجوات الانتقالية بين الدراسات غير السريرية والسريرية4.
تم إجراء أبحاث هائلة على مر السنين لفهم سبب النمط الظاهري الضمني غير الناضج وإيجاد طرق لدفع عملية نضج iPSC-CMs البشرية في المختبر.
تبين أن الافتقار إلى إشارات النضج القلبي مثل أوقات زراعة الخلايا المطولة ، أو عدم وجود أنواع أخرى من الخلايا في المنطقة المجاورة ، أو نقص التحفيز الهرموني يؤثر على عملية النضج5. أيضا ، تم تحديد البيئة غير الفسيولوجية لألواح زراعة الخلايا العادية كسبب مهم يعيق نضوج iPSC-CMs البشرية ، بسبب تصلب الركيزة الفسيولوجية المفقودة لقلب الإنسان الأصلي 5,6.
تم تطوير أنظمة فحص مختلفة مع التركيز على الظروف الفسيولوجية الأصلية لمعالجة هذه المشكلة ، بما في ذلك أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد حيث يتم محاذاة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتشبه بنية القلب الأصلية بدلا من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد النموذجية7. على الرغم من الحصول على نضج محسن باستخدام فحوصات 3D ، فإن الحاجة إلى قوة عاملة ماهرة وإنتاجية منخفضة لهذه الأنظمة تعوق الاستخدام الوفير لهذا في عملية تطوير الأدوية ، حيث يلعب الوقت والتكلفة دورا أساسيا في تقييم العلاجات الجديدة على المستوى المالي8.
قراءات مهمة للسلامة التقييم الدوائي والسمي للعلاجات الجديدة هي تغييرات في الخصائص الوظيفية والهيكلية ل iPSC-CMs البشرية ، لأن التفاعلات الدوائية الضارة التي يسببها المركب لنظام القلب والأوعية الدموية عادة ما تؤثر على أحد هذه الخصائص أو كليهما 1,9. الأمثلة المعروفة لمثل هذه التفاعلات السلبية الواسعة هي الأدوية المضادة للسرطان من عائلة أنثراسيكلين. هنا ، يتم الإبلاغ على نطاق واسع عن الآثار الهيكلية الوظيفية والضارة الخطرة على نظام القلب والأوعية الدموية أثناء وبعد علاج السرطان في المرضى وكذلك مع المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر 10,11.
في هذه الدراسة ، وصفنا منهجية شاملة لتقييم كل من الآثار الجانبية المركبة الوظيفية والهيكلية على hiPSC-CMs. تتضمن المنهجية تحليل قوة انقباض خلايا عضلة القلب وتحليل المعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP). يتم قياس قوة الانقباض في ظل الظروف الميكانيكية الفسيولوجية ، مع الخلايا المستزرعة على ركائز سيليكون ناعمة (33 كيلو باسكال) ، مما يعكس البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب البشرية الأصلية.
تم تجهيز النظام بألواح 96 بئرا لتحليل الإنتاجية العالية ل iPSC-CMs البشرية للدراسات الدوائية والسمية لسلامة القلب قبل السريرية ، وبالتالي يوفر ميزة لنهج 3D المستخدمة حاليا مثل Langendorff القلب أو شرائح القلب12,13.
بالتفصيل ، يتكون النظام الهجين من وحدتين ، إما لتقييم انقباض القلب في ظل الظروف الفسيولوجية أو تحليل السمية الهيكلية الخلوية في الوقت الفعلي 6,14. تعمل كلتا الوحدتين مع لوحات متخصصة عالية الإنتاجية من 96 بئرا للحصول على البيانات بسرعة وفعالية من حيث التكلفة.
بدون الحاجة إلى بناء 3D ، تستخدم وحدة الانقباض لوحات خاصة تحتوي على أغشية سيليكون مرنة كركيزة للخلايا بدلا من الزجاج الصلب أو البلاستيك الذي تتكون منه عادة لوحات زراعة الخلايا العادية. تعكس الأغشية خصائص القلب الميكانيكية الحيوية البشرية النموذجية ، وبالتالي تحاكي الظروف في الجسم الحي بطريقة إنتاجية عالية. في حين أن iPSC-CMs البشرية غالبا ما تفشل في إظهار سلوك خلايا عضلة القلب البالغة فيما يتعلق بتقلص التقلص العضلي الإيجابي الناجم عن المركب في المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا14 ، يمكن تقييم تفاعل أكثر شبها بالبالغين عندما يتم استزراع الخلايا على ألواح وحدة الانقباض. في الدراسات السابقة ، ثبت أن iPSC-CMs تظهر تأثيرات مؤثرة في التقلص العضلي إيجابية عند العلاج بمركبات مثل الأيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil 6,15. هنا ، يمكن تقييم معلمات انقباض متعددة ، مثل المعلمات الأولية مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ، ومدة الضرب ، ومعدل الضرب ، بالإضافة إلى المعلمات الثانوية لدورة الانكماش مثل المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، والانكماش ، ومنحدرات الاسترخاء ، وتغيرات معدل الضرب ، وعدم انتظام ضربات القلب (الشكل التكميلي 1)16 . يتم تقييم التغيرات التي يسببها الدواء في جميع المعلمات بشكل غير جراحي بواسطة استشعار المسافة بالسعة. يتم تحليل البيانات الأولية لاحقا بواسطة برامج متخصصة.
تضيف وحدة السمية الهيكلية معاوقة فريدة ومعلمات EFP كقراءة للسمية الخلوية الهيكلية وتحليل الخصائص الفيزيولوجية الكهربية17,18. تكشف تقنية التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية عن التغيرات التي يسببها المركب في كثافة الخلايا أو سلامة الخلية والطبقة الأحادية التي يتم رصدها في الوقت الفعلي ، كما هو موضح مع iPSC-CMs البشرية المعالجة بمركبات سامة للقلبمعروفة 13. مع قراءات المعاوقة على ترددات مختلفة (1-100 كيلو هرتز) ، من الممكن تشريح الاستجابة الفسيولوجية بشكل أكبر ، وبالتالي يمكن الكشف عن التغييرات في تضاريس الغشاء أو تقاطعات الخلية الخلوية أو مصفوفة الخلية. يتيح تسجيل EFP الإضافي ل iPSC-CMs البشرية تحليل التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية الناتجة عن المعالجة المركبة ، كما هو موضح في ضوء دراسة CiPA17,19.
في هذه الدراسة ، تم استخدام iPSC-CMs البشرية ، وعولجوا ب epirubicin و doxorubicin ، وكلاهما موصوف جيدا بأنه أنثراسيكلين سام للقلب ، و erlotinib ، مثبط التيروزين كيناز (TKI) مع خطر منخفض إلى حد ما من سمية القلب والأوعية الدموية. تم إجراء تقييم مزمن باستخدام epirubicin و doxorubicin و erlotinib لمدة 5 أيام. تظهر النتيجة تغيرات طفيفة في الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجة الخلايا ب erlotinib ، ولكن انخفاض السمية المعتمدة على الوقت والجرعة في سعة الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجتها ب epirubicin و doxorubicin على التوالي. تم إجراء القياسات الحادة باستخدام نيفيديبين حاصرات قنوات الكالسيوم وأظهرت انخفاضا في سعة الانقباض ومدة جهد المجال ومقاومة القاعدة ، مما يدل على الآثار الجانبية السمية للقلب لهذا المركب على المستويات الوظيفية والهيكلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد النظام الهجين للمقاومة / EFP / الانقباض منهجية شاملة للتقييم الدوائي والسمي عالي الإنتاجية للالتزامات القلبية لتطوير الأدوية قبل السريرية. يوفر نهجا حديثا لاختبار السلامة قبل السريرية دون استخدام النماذج الحيوانية ، ولكن مع قدرات إنتاجية أعلى تقلل بشكل كبير من الوقت والتكاليف. هذا الن…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من الوزارة الاتحادية الألمانية للشؤون الاقتصادية والعمل المناخي (ZIM) ومن الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (KMUinnovativ). نشكر شركة FUJIFILM Cellular Dynamics، Inc (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب و Ncardia B.V. (ليدن ، هولندا) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب ، المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
