Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung
Summary
Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.
Abstract
Die Beurteilung der kardialen Kontraktilität ist von immenser Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapeutika und deren sicheren Übergang in die klinischen Stadien. Während human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) vielversprechend sind, als humanrelevantes Modell in präklinischen Phasen der Arzneimittelforschung und Sicherheitspharmakologie zu dienen, ist ihre Reife in der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer noch umstritten und wird ständig weiterentwickelt. Wir präsentieren eine hybride Kontraktilitäts- und Impedanz-/extrazelluläres Feldpotenzial (EFP)-Technologie, die einer branchenüblichen 96-Well-Plattform signifikante Reifungsmerkmale hinzufügt.
Das Impedanz-/EFP-System überwacht die zelluläre Funktionalität in Echtzeit. Neben der Schlagrate kontraktiler Zellen erkennen die elektrischen Impedanzspektroskopie-Anzeigen verbindungsinduzierte morphologische Veränderungen wie Zelldichte und Integrität der zellulären Monoschicht. In der anderen Komponente des Hybridzellanalysesystems werden die Zellen auf biokonformen Membranen kultiviert, die die mechanische Umgebung von echtem Herzgewebe nachahmen. Diese physiologische Umgebung unterstützt die Reifung von hiPSC-CMs in vitro, was nach der Behandlung mit Isoproterenol, S-Bay K8644 oder omecamtiver Mecarbil zu eher adulten kontraktilen Reaktionen führt, einschließlich positiver inotroper Effekte. Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/mm2) und die Schlagdauer zeigen auch nachgeschaltete Effekte von Verbindungen mit Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften und den Umgang mit Kalzium.
Das Hybridsystem bietet das ideale Werkzeug für die ganzheitliche Zellanalyse und ermöglicht eine präklinische kardiale Risikobewertung über die aktuellen Perspektiven humanrelevanter zellbasierter Assays hinaus.
Introduction
Eines der Hauptziele der modernen Arzneimittelentwicklung ist die Verbesserung der Erfolgsrate neuer Therapeutika in der Wirkstoffforschungspipeline vom Labor bis zum Krankenbett. Pharmakologische Sicherheitstests dieser neuen Medikamente zeigen häufig unerwünschte Arzneimittelwirkungen auf das Herz-Kreislauf-System, die fast ein Viertel der Fluktuationsrate in präklinischen Stadien ausmachen1. Die Entwicklung und Integration neuer Ansatzmethoden (NAMs) spielt eine Schlüsselrolle bei der Modernisierung der präklinischen Bewertung, insbesondere der Kernorgane der Batterie wie des Herzens. Da es sich bei diesen Methoden um tierversuchsfreie Ansätze handelt, wurde die Verwendung humanbasierter Zellmodelle wie Kardiomyozyten (CMs) mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) in den letzten zehn Jahren zum Arbeitspferd für die moderne Bewertung von sicherheitspharmakologischen und toxikologischen Fragestellungen2. Weit verbreitete Assay-Systeme für solche Untersuchungen sind Mikroelektroden-Arrays (MEA) und spannungsempfindliche farbstoffbasierte experimentelle Ansätze3.
Nichtsdestotrotz stellt die behauptete phänotypische und funktionelle Unreife dieses Zelltyps Hindernisse für ein ideales humanbasiertes Zellmodell dar, mit dem Potenzial, translationale Lücken zwischen nicht-klinischen und klinischen Studien zu verringern4.
Im Laufe der Jahre wurde eine enorme Forschung durchgeführt, um den Grund für den implizierten unreifen Phänotyp zu verstehen und Wege zu finden, den Reifungsprozess von humanen iPSC-CMs in vitro voranzutreiben.
Es wurde gezeigt, dass fehlende kardiale Reifungssignale wie verlängerte Zellkulturzeiten, das Fehlen anderer Zelltypen in der Nähe oder ein Mangel an hormoneller Stimulation den Reifungsprozess beeinflussen5. Auch die nicht-physiologische Umgebung regulärer Zellkulturplatten wurde als eine signifikante Ursache identifiziert, die die Reifung von humanen iPSC-CMs aufgrund der fehlenden physiologischen Substratsteifigkeit des nativen menschlichen Herzens behindert 5,6.
Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Assay-Systeme entwickelt, die sich auf native physiologische Bedingungen konzentrieren, darunter 3D-Zellkultursysteme, bei denen Zellen dreidimensional ausgerichtet sind, um einer nativen Herzarchitektur anstelle von typischen zweidimensionalen Zellkulturen zu ähneln7. Obwohl mit 3D-Assays eine verbesserte Reifung erreicht wird, behindern der Bedarf an qualifizierten Arbeitskräften und der geringe Durchsatz dieser Systeme eine reichliche Verwendung im Arzneimittelentwicklungsprozess, da Zeit und Kosten eine grundlegende Rolle bei der Bewertung neuer Therapeutika auf finanzieller Ebene spielen8.
Wichtige Erkenntnisse für die pharmakologische und toxikologische Sicherheitsbewertung neuer Therapeutika sind Veränderungen der funktionellen und strukturellen Eigenschaften humaner iPSC-CMs, da verbindungsinduzierte unerwünschte Arzneimittelwirkungen des kardiovaskulären Systems in der Regel eine oder beide dieser Eigenschaften beeinflussen 1,9. Bekannte Beispiele für solche breiten Nebenwirkungen sind Krebsmedikamente der Anthrazyklin-Familie. Hier wird ausführlich über gefährliche funktionelle und nachteilige strukturelle Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System während und nach der Krebsbehandlung bei Patienten sowie mit zellbasierten In-vitro-Assays berichtet10,11.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine umfassende Methodik zur Bewertung von funktionellen und strukturellen Nebenwirkungen von hPSC-CMs. Die Methodik umfasst die Analyse der Kardiomyozytenkontraktionskraft und der Impedanz/Analyse des extrazellulären Feldpotentials (EFP). Die kontraktile Kraft wird unter physiologisch-mechanischen Bedingungen gemessen, wobei die Zellen auf weichen (33 kPa) Silikonsubstraten kultiviert werden, die die mechanische Umgebung des natürlichen menschlichen Herzgewebes widerspiegeln.
Das System ist mit 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzanalyse von humanen iPSC-CMs für präklinische pharmakologische und toxikologische Studien zur kardialen Sicherheit ausgestattet und bietet damit einen Vorteil gegenüber derzeit verwendeten 3D-Ansätzen wie Langendorff-Herz oder Herzschnitten12,13.
Im Detail besteht das Hybridsystem aus zwei Modulen, entweder zur Beurteilung der kardialen Kontraktilität unter physiologischen Bedingungen oder zur Analyse der zellulären Strukturtoxizitätin Echtzeit 6,14. Beide Module arbeiten mit speziellen 96-Well-Platten mit hohem Durchsatz für eine schnelle und kostengünstige Datenerfassung.
Ohne dass ein 3D-Konstrukt erforderlich ist, verwendet das Kontraktilitätsmodul spezielle Platten, die flexible Silikonmembranen als Substrat für die Zellen enthalten, anstelle des steifen Glases oder Kunststoffs, aus dem normale Zellkulturplatten normalerweise bestehen. Die Membranen spiegeln typische biomechanische Herzeigenschaften des Menschen wider und ahmen daher in vivo Bedingungen im Hochdurchsatz nach. Während humane iPSC-CMs in anderen zellbasierten Assays oft kein adultes Kardiomyozytenverhalten in Bezug auf die verbindungsinduzierte positive Inotropie zeigen14, kann eine erwachsenere Reaktion beurteilt werden, wenn die Zellen auf den Platten des Kontraktilitätsmoduls kultiviert werden. In früheren Studien wurde gezeigt, dass iPSC-CMs positive inotrope Wirkungen bei der Behandlung mit Verbindungen wie Isoproterenol, S-Bay K8644 oder Omecamtiv Mecarbil 6,15 zeigen. Hier können mehrere Kontraktilitätsparameter bewertet werden, wie z. B. primäre Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/mm2), die Schlagdauer und die Schlagfrequenz sowie sekundäre Parameter des Kontraktionszyklus wie Fläche unter der Kurve, Kontraktions- und Relaxationssteigungen, Schlaggeschwindigkeitsschwankungen und Arrhythmien (ergänzende Abbildung 1)16 . Medikamenteninduzierte Veränderungen in allen Parametern werden nicht-invasiv durch kapazitive Distanzmessung erfasst. Die Rohdaten werden anschließend von einer speziellen Software analysiert.
Das Modul für strukturelle Toxizität fügt seine einzigartigen Impedanz- und EFP-Parameter als Anzeige für die strukturelle zelluläre Toxizität und die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaftenhinzu 17,18. Die elektrische Impedanzspektroskopie-Technologie zeigt verbindungsinduzierte Veränderungen der Zelldichte oder der Zell- und Monoschichtintegrität, die in Echtzeit überwacht werden, wie bei humanen iPSC-CMs gezeigt wurde, die mit bekannten kardiotoxischen Verbindungen behandelt wurden13. Mit Impedanzanzeigen bei verschiedenen Frequenzen (1-100 kHz) ist es möglich, eine physiologische Reaktion weiter zu sezieren und somit Veränderungen in der Membrantopographie, Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Verbindungen aufzudecken. Die zusätzliche EFP-Aufzeichnung von humanen iPSC-CMs ermöglicht darüber hinaus die Analyse von elektrophysiologischen Effekten, die durch die Behandlung mit Wirkstoffen hervorgerufen werden, wie im Lichte der CiPA-Studiegezeigt wurde 17,19.
In der vorliegenden Studie wurden humane iPSC-CMs verwendet, die mit Epirubicin und Doxorubicin, die beide als kardiotoxische Anthrazykline beschrieben werden, und Erlotinib, einem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) mit einem relativ geringen Risiko für kardiovaskuläre Toxizität, behandelt wurden. Die chronische Beurteilung mit Epirubicin, Doxorubicin und Erlotinib wurde über 5 Tage durchgeführt. Das Ergebnis zeigt geringfügige Veränderungen der Kontraktilität und Basenimpedanz, wenn die Zellen mit Erlotinib behandelt wurden, aber eine zeit- und dosisabhängige toxische Abnahme der Kontraktionsamplitude und Basenimpedanz, wenn sie mit Epirubicin bzw. Doxorubicin behandelt wurden. Akute Messungen wurden mit dem Calciumkanalblocker Nifedipin durchgeführt und zeigten eine Abnahme der Kontraktionsamplitude, der Feldpotentialdauer und der Basenimpedanz, was kardiotoxische Nebenwirkungen dieser Verbindung sowohl auf funktioneller als auch auf struktureller Ebene zeigte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Impedanz-/EFP-/Kontraktilitäts-Hybridsystem ist eine umfassende Methodik für die pharmakologische und toxikologische Bewertung der kardialen Verbindlichkeiten im Hochdurchsatz für die präklinische Arzneimittelentwicklung. Es bietet einen modernen Ansatz für präklinische Sicherheitstests ohne den Einsatz von Tiermodellen, aber mit höheren Durchsatzkapazitäten, die Zeit und Kosten erheblich reduzieren. Dieses System hat das Potenzial, als komplementärer Ansatz für das Langendorff-Herz und andere Tiermodelle z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuwendungen des Bundesministeriums für Wirtschaft und Klimapolitik (ZIM) und des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (KMUinnovativ) gefördert. Wir danken FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) für die freundliche Bereitstellung von Kardiomyozyten und Ncardia B.V. (Leiden, Niederlande) für die freundliche Bereitstellung von Kardiomyozyten, die in dieser Studie verwendet wurden.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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