Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco
Summary
L’analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell’integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l’uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.
Abstract
La valutazione della contrattilità cardiaca è di immensa importanza per lo sviluppo di nuove terapie e la loro transizione sicura nelle fasi cliniche. Mentre i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC-CM) promettono di servire come modello rilevante per l’uomo nelle fasi precliniche della scoperta di farmaci e della farmacologia di sicurezza, la loro maturità è ancora controversa nella comunità scientifica e in costante sviluppo. Presentiamo una contrattilità ibrida e una tecnologia EFP (impedenza/potenziale di campo extracellulare), aggiungendo significative caratteristiche di pro-maturazione a una piattaforma standard del settore a 96 pozzetti.
Il sistema impedenza/EFP monitora la funzionalità cellulare in tempo reale. Oltre alla frequenza di battimento delle cellule contrattili, le letture della spettroscopia di impedenza elettrica rilevano cambiamenti morfologici indotti da composti come la densità cellulare e l’integrità del monostrato cellulare. Nell’altro componente del sistema di analisi delle cellule ibride, le cellule sono coltivate su membrane bio-compatibili che imitano l’ambiente meccanico del tessuto cardiaco reale. Questo ambiente fisiologico supporta la maturazione di hiPSC-CMs in vitro, portando a risposte contrattili più simili a quelle degli adulti, inclusi effetti inotropi positivi dopo il trattamento con isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil. Parametri come l’ampiezza della forza di contrazione (mN/mm2) e la durata del battito rivelano anche effetti a valle dei composti con influenza sulle proprietà elettrofisiologiche e sulla manipolazione del calcio.
Il sistema ibrido fornisce lo strumento ideale per l’analisi olistica delle cellule, consentendo la valutazione preclinica del rischio cardiaco oltre le attuali prospettive dei saggi cellulari rilevanti per l’uomo.
Introduction
Uno dei principali obiettivi dello sviluppo di farmaci moderni è il miglioramento del tasso di successo da banco a letto di nuove terapie nella pipeline di scoperta di farmaci. I test farmacologici di sicurezza di questi nuovi farmaci spesso rivelano reazioni avverse al farmaco sul sistema cardiovascolare che rappresentano quasi un quarto del tasso di abbandono del farmaco nelle fasi precliniche1. Lo sviluppo e l’integrazione di nuove metodologie di approccio (NAM) svolgono un ruolo chiave nella modernizzazione della valutazione preclinica, in particolare degli organi della batteria centrale come il cuore. Poiché queste metodologie sono approcci privi di animali, l’uso di modelli cellulari basati sull’uomo come i cardiomiociti (CM) di origine delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è diventato il cavallo di battaglia nell’ultimo decennio per la moderna valutazione delle questioni farmacologiche e tossicologiche di sicurezza2. I sistemi di analisi ampiamente utilizzati per tali indagini sono gli array di microelettrodi (MEA) e gli approcci sperimentali basati su coloranti sensibilialla tensione 3.
Tuttavia, la presunta immaturità fenotipica e funzionale di questo tipo di cellula pone ostacoli sulla strada di un modello cellulare ideale basato sull’uomo, con il potenziale di ridurre i divari traslazionali tra studi non clinici e clinici4.
Nel corso degli anni sono state condotte enormi ricerche per comprendere la ragione del fenotipo immaturo implicito e per trovare modi per spingere il processo di maturazione delle iPSC-CM umane in vitro.
La mancanza di segnali di maturazione cardiaca come tempi di coltura cellulare prolungati, l’assenza di altri tipi di cellule nelle vicinanze o la mancanza di stimolazione ormonale hanno dimostrato di influenzare il processo di maturazione5. Inoltre, l’ambiente non fisiologico delle piastre di coltura cellulare regolare è stato identificato come una causa significativa che impedisce la maturazione delle iPSC-CM umane, a causa della mancanza di rigidità fisiologica del substrato del cuore umano nativo 5,6.
Per affrontare questo problema sono stati sviluppati diversi sistemi di analisi incentrati sulle condizioni fisiologiche native, compresi i sistemi di coltura cellulare 3D in cui le cellule sono allineate tridimensionalmente per assomigliare all’architettura cardiaca nativa anziché alle tipiche colture cellulari bidimensionali7. Sebbene si ottenga una migliore maturazione con saggi 3D, la necessità di una forza lavoro qualificata e la bassa produttività di questi sistemi ostacolano un uso abbondante di questo nel processo di sviluppo dei farmaci, poiché tempi e costi giocano un ruolo fondamentale nella valutazione di nuove terapie a livello finanziario8.
Letture importanti per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza di nuove terapie sono i cambiamenti nelle caratteristiche funzionali e strutturali delle iPSC-CM umane, poiché le reazioni avverse al farmaco indotte da composti del sistema cardiovascolare di solito influenzano una o entrambe queste proprietà 1,9. Esempi ben noti di reazioni avverse così ampie sono i farmaci antitumorali della famiglia delle antracicline. Qui, effetti funzionali e strutturali avversi pericolosi sul sistema cardiovascolare sono ampiamente riportati durante e dopo il trattamento del cancro nei pazienti, nonché con saggi in vitro basati su cellule10,11.
Nel presente studio, descriviamo una metodologia completa per la valutazione degli effetti collaterali dei composti sia funzionali che strutturali sulle hiPSC-CM. La metodologia include l’analisi della forza contrattile dei cardiomiociti e l’analisi dell’impedenza/potenziale di campo extracellulare (EFP). La forza contrattile viene misurata in condizioni meccaniche fisiologiche, con le cellule coltivate su substrati di silicone morbido (33 kPa), che riflettono l’ambiente meccanico del tessuto cardiaco umano nativo.
Il sistema è dotato di piastre a 96 pozzetti per l’analisi ad alta produttività di iPSC-CM umane per studi farmacologici e tossicologici preclinici sulla sicurezza cardiaca, e quindi offre un vantaggio agli approcci 3D attualmente utilizzati come il cuore di Langendorff o le fette di cuore12,13.
Nel dettaglio, il sistema ibrido si compone di due moduli, sia per la valutazione della contrattilità cardiaca in condizioni fisiologiche che per l’analisi della tossicità strutturale cellulare in tempo reale 6,14. Entrambi i moduli funzionano con piastre specializzate ad alta produttività a 96 pozzetti per un’acquisizione dei dati rapida ed economica.
Senza la necessità di un costrutto 3D, il modulo di contrattilità impiega piastre speciali che contengono membrane siliconiche flessibili come substrato per le cellule invece del vetro rigido o della plastica di cui di solito sono costituite le normali piastre di coltura cellulare. Le membrane riflettono le tipiche proprietà del cuore biomeccanico umano e quindi imitano le condizioni in vivo in modo ad alta produttività. Mentre le iPSC-CM umane spesso non riescono a mostrare il comportamento dei cardiomiociti adulti per quanto riguarda l’inotropia positiva indotta da composti in altri saggi basati su cellule14, una reazione più simile all’adulto può essere valutata quando le cellule sono coltivate sulle piastre del modulo di contrattilità. In studi precedenti, è stato dimostrato che le iPSC-CM mostrano effetti inotropi positivi al trattamento con composti come isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil 6,15. Qui possono essere valutati più parametri di contrattilità, come parametri primari come l’ampiezza della forza di contrazione (mN / mm2), la durata del battito e la frequenza di battito, nonché parametri secondari del ciclo di contrazione come l’area sotto la curva, le pendenze di contrazione e rilassamento, le variazioni della frequenza di battito e le aritmie (Figura supplementare 1)16 . I cambiamenti indotti dal farmaco in tutti i parametri sono valutati in modo non invasivo mediante il rilevamento capacitivo della distanza. I dati grezzi vengono analizzati successivamente da software specializzati.
Il modulo di tossicità strutturale aggiunge i suoi parametri unici di impedenza e EFP come lettura per la tossicità cellulare strutturale e l’analisi delle proprietà elettrofisiologiche17,18. La tecnologia della spettroscopia di impedenza elettrica rivela cambiamenti indotti da composti nella densità cellulare o nell’integrità delle cellule e dei monostrati monitorati in tempo reale, come mostrato con iPSC-CM umane trattate con composti cardiotossici noti13. Con letture di impedenza a frequenze diverse (1-100 kHz) è possibile sezionare ulteriormente una risposta fisiologica, e quindi è possibile rivelare cambiamenti nella topografia della membrana, nelle giunzioni cellula-cellula o cellula-matrice. La registrazione EFP aggiuntiva delle iPSC-CM umane consente inoltre l’analisi degli effetti elettrofisiologici indotti dal trattamento con composti, come è stato dimostrato alla luce dello studio CiPA17,19.
Nel presente studio, sono state impiegate iPSC-CM umane, trattate con epirubicina e doxorubicina, entrambe ben descritte come antracicline cardiotossiche, ed erlotinib, un inibitore della tirosin-chinasi (TKI) con un rischio piuttosto basso di tossicità cardiovascolare. La valutazione cronica con epirubicina, doxorubicina ed erlotinib è stata eseguita per 5 giorni. Il risultato mostra lievi cambiamenti nella contrattilità e nell’impedenza basale quando le cellule sono state trattate con erlotinib, ma una diminuzione tossica dipendente dal tempo e dalla dose dell’ampiezza della contrazione e dell’impedenza basale quando trattati rispettivamente con epirubicina e doxorubicina. Le misurazioni acute sono state eseguite con il calcio-antagonista nifedipina e mostrano una diminuzione dell’ampiezza della contrazione, della durata del potenziale di campo e dell’impedenza di base, dimostrando effetti collaterali cardiotossici di questo composto a livello funzionale e strutturale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema ibrido impedenza/EFP/contrattilità è una metodologia completa per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza ad alta produttività delle passività cardiache per lo sviluppo preclinico di farmaci. Fornisce un approccio moderno per i test di sicurezza preclinici senza l’uso di modelli animali, ma con capacità di produttività più elevate che riducono significativamente tempi e costi. Questo sistema ha il potenziale per essere utilizzato come approccio complementare per il Langendorff Heart…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero federale tedesco per gli affari economici e l’azione per il clima (ZIM) e dal Ministero federale tedesco dell’istruzione e della ricerca (KMUinnovativ). Ringraziamo FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) per aver gentilmente fornito cardiomiociti e Ncardia B.V. (Leiden, Paesi Bassi) per aver gentilmente fornito i cardiomiociti, utilizzati in questo studio.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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