Sistema de análisis de células híbridas para evaluar cambios estructurales y contráctiles de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para la evaluación preclínica del riesgo cardíaco
Summary
El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.
Abstract
La evaluación de la contractilidad cardíaca es de inmensa importancia para el desarrollo de nuevas terapias y su transición segura a las etapas clínicas. Si bien los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) prometen servir como un modelo relevante para humanos en las fases preclínicas del descubrimiento de fármacos y la farmacología de seguridad, su madurez sigue siendo controvertida en la comunidad científica y en constante desarrollo. Presentamos una tecnología híbrida de contractilidad e impedancia / potencial de campo extracelular (EFP), agregando características significativas de pro-maduración a una plataforma de 96 pocillos estándar de la industria.
El sistema de impedancia/EFP monitorea la funcionalidad celular en tiempo real. Además de la velocidad de latido de las células contráctiles, las lecturas de espectroscopia de impedancia eléctrica detectan cambios morfológicos inducidos por compuestos, como la densidad celular y la integridad de la monocapa celular. En el otro componente del sistema de análisis de células híbridas, las células se cultivan en membranas biocompatibles que imitan el entorno mecánico del tejido cardíaco real. Este entorno fisiológico apoya la maduración de hiPSC-CMs in vitro, lo que lleva a respuestas contráctiles más adultas que incluyen efectos inotrópicos positivos después del tratamiento con isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil. Parámetros como la amplitud de la fuerza de contracción (mN/mm2) y la duración del batido también revelan efectos posteriores de compuestos con influencia en las propiedades electrofisiológicas y el manejo del calcio.
El sistema híbrido proporciona la herramienta ideal para el análisis celular holístico, permitiendo la evaluación preclínica del riesgo cardíaco más allá de las perspectivas actuales de los ensayos basados en células relevantes para el ser humano.
Introduction
Uno de los principales objetivos del desarrollo de fármacos modernos es la mejora de la tasa de éxito de la mesa a la cama de nuevas terapias en la línea de descubrimiento de fármacos. Las pruebas farmacológicas de seguridad de estos nuevos fármacos a menudo revelan reacciones adversas al sistema cardiovascular que representan casi una cuarta parte de la tasa de deserción del fármaco en las etapas preclínicas1. El desarrollo y la integración de nuevas metodologías de enfoque (NAM) desempeñan un papel clave en la modernización de la evaluación preclínica, en particular los órganos centrales de la batería como el corazón. Dado que estas metodologías son enfoques libres de animales, el uso de modelos celulares basados en humanos como los cardiomiocitos (CM) de origen de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se convirtió en el caballo de batalla durante la última década para la evaluación moderna de cuestiones farmacológicas y toxicológicas de seguridad2. Los sistemas de ensayo ampliamente utilizados para tales investigaciones son la matriz de microelectrodos (MEA) y los enfoques experimentales basados en colorantes sensibles al voltaje3.
Sin embargo, la pretendida inmadurez fenotípica y funcional de este tipo celular pone obstáculos en el camino de un modelo celular ideal basado en humanos, con el potencial de reducir las brechas traslacionales entre los estudios no clínicos y clínicos4.
Se han realizado enormes investigaciones a lo largo de los años para comprender la razón del fenotipo inmaduro implícito y para encontrar formas de impulsar el proceso de maduración de los iPSC-CM humanos in vitro.
Se demostró que la falta de señales de maduración cardíaca, como tiempos prolongados de cultivo celular, ausencia de otros tipos celulares en la vecindad o falta de estimulación hormonal, afecta el proceso de maduración5. Además, el ambiente no fisiológico de las placas de cultivo celular regular fue identificado como una causa significativa que impide la maduración de las iPSC-CM humanas, debido a la rigidez del sustrato fisiológico faltante del corazón humano nativo 5,6.
Se desarrollaron diferentes sistemas de ensayo con un enfoque en las condiciones fisiológicas nativas para abordar este problema, incluidos los sistemas de cultivo celular 3D donde las células se alinean tridimensionalmente para parecerse a la arquitectura cardíaca nativa en lugar de los típicos cultivos celulares bidimensionales7. Aunque la maduración mejorada se obtiene con ensayos 3D, la necesidad de una mano de obra calificada y el bajo rendimiento de estos sistemas dificulta un uso abundante de esto en el proceso de desarrollo de fármacos, ya que el tiempo y el costo juegan un papel fundamental en la evaluación de nuevas terapias a nivel financiero8.
Las lecturas importantes para la evaluación farmacológica y toxicológica de la seguridad de nuevas terapias son los cambios en las características funcionales y estructurales de las iPSC-CM humanas, ya que las reacciones adversas del sistema cardiovascular inducidas por compuestos generalmente afectan una o ambas de estas propiedades 1,9. Ejemplos bien conocidos de reacciones adversas tan amplias son los medicamentos contra el cáncer de la familia de las antraciclinas. Aquí, los efectos funcionales y estructurales adversos peligrosos sobre el sistema cardiovascular son ampliamente reportados durante y después del tratamiento del cáncer en pacientes, así como con ensayos basados en células in vitro 10,11.
En el presente estudio, describimos una metodología integral para la evaluación de los efectos secundarios compuestos funcionales y estructurales en los hiPSC-CM. La metodología incluye el análisis de la fuerza contráctil de los cardiomiocitos y el análisis de impedancia/potencial de campo extracelular (EFP). La fuerza contráctil se mide en condiciones mecánicas fisiológicas, con las células cultivadas en sustratos de silicona blanda (33 kPa), lo que refleja el entorno mecánico del tejido cardíaco humano nativo.
El sistema está equipado con placas de 96 pocillos para el análisis de alto rendimiento de iPSC-CM humanos para estudios farmacológicos y toxicológicos preclínicos de seguridad cardíaca, y por lo tanto proporciona una ventaja a los enfoques 3D utilizados actualmente como el corazón de Langendorff o los cortes de corazón12,13.
En detalle, el sistema híbrido consta de dos módulos, ya sea para la evaluación de la contractilidad cardíaca en condiciones fisiológicas o para el análisis de la toxicidad estructural celular en tiempo real 6,14. Ambos módulos funcionan con placas especializadas de 96 pocillos de alto rendimiento para una adquisición de datos rápida y rentable.
Sin la necesidad de una construcción 3D, el módulo de contractilidad emplea placas especiales que contienen membranas de silicona flexibles como sustrato para las células en lugar del vidrio rígido o plástico en el que generalmente consisten las placas de cultivo celular regulares. Las membranas reflejan las propiedades biomecánicas típicas del corazón humano y, por lo tanto, imitan las condiciones in vivo de una manera de alto rendimiento. Mientras que las iPSC-CM humanas a menudo no muestran un comportamiento cardiomiocitario adulto con respecto a la inotropía positiva inducida por compuestos en otros ensayos basados en células14, se puede evaluar una reacción más adulta cuando las células se cultivan en las placas del módulo de contractilidad. En estudios previos, se ha demostrado que los iPSC-CM exhiben efectos inotrópicos positivos sobre el tratamiento con compuestos como isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil 6,15. Aquí, se pueden evaluar múltiples parámetros de contractilidad, como parámetros primarios como la amplitud de la fuerza de contracción (mN / mm2), la duración del latido y la frecuencia de latido, así como parámetros secundarios del ciclo de contracción como el área debajo de la curva, las pendientes de contracción y relajación, las variaciones de la frecuencia de latido y las arritmias (Figura complementaria 1)16 . Los cambios inducidos por fármacos en todos los parámetros se evalúan de forma no invasiva mediante detección de distancia capacitiva. Los datos en bruto son analizados posteriormente por un software especializado.
El módulo de toxicidad estructural añade sus parámetros únicos de impedancia y EFP como lectura para la toxicidad celular estructural y el análisis de propiedades electrofisiológicas17,18. La tecnología de espectroscopia de impedancia eléctrica revela cambios inducidos por compuestos en la densidad celular o la integridad celular y monocapa monitoreados en tiempo real, como se muestra con iPSC-CMs humanos tratados con compuestos cardiotóxicos conocidos13. Con lecturas de impedancia a diferentes frecuencias (1-100 kHz) es posible diseccionar aún más una respuesta fisiológica, y así revelar cambios en la topografía de la membrana, las uniones célula-célula o célula-matriz es alcanzable. El registro adicional de EFP de iPSC-CMs humanas permite además el análisis de los efectos electrofisiológicos provocados por el tratamiento compuesto, como se demostró a la luz del estudio CiPA17,19.
En el presente estudio, se emplearon iPSC-CM humanos, tratados con epirrubicina y doxorrubicina, ambas bien descritas como antraciclinas cardiotóxicas, y erlotinib, un inhibidor de la tirosina cinasa (TKI) con un riesgo bastante bajo de toxicidad cardiovascular. La evaluación crónica con epirrubicina, doxorrubicina y erlotinib se realizó durante 5 días. El resultado muestra cambios menores en la contractilidad y la impedancia de base cuando las células fueron tratadas con erlotinib, pero una disminución tóxica dependiente del tiempo y la dosis en la amplitud de contracción y la impedancia de base cuando se trataron con epirrubicina y doxorrubicina respectivamente. Las mediciones agudas se realizaron con el bloqueador de los canales de calcio nifedipino y muestran una disminución en la amplitud de la contracción, la duración del potencial de campo y la impedancia base, demostrando efectos secundarios cardiotóxicos de este compuesto a nivel funcional y estructural.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema híbrido de impedancia/EFP/contractilidad es una metodología integral para la evaluación farmacológica y toxicológica de seguridad de alto rendimiento de las responsabilidades cardíacas para el desarrollo preclínico de fármacos. Proporciona un enfoque moderno para las pruebas de seguridad preclínicas sin el uso de modelos animales, pero con mayores capacidades de rendimiento que reducen significativamente el tiempo y los costos. Este sistema tiene el potencial de ser utilizado como un enfoque complemen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio Federal Alemán de Asuntos Económicos y Acción Climática (ZIM) y del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (KMUinnovativ). Agradecemos a FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EE. UU.) por proporcionar amablemente cardiomiocitos y a Ncardia B.V. (Leiden, Países Bajos) por proporcionar amablemente cardiomiocitos, utilizados en este estudio.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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