用于评估人iPSC来源心肌细胞结构和收缩变化的杂交细胞分析系统，用于临床前心脏风险评估
Summary
分析人iPSC来源的心肌细胞的收缩功能和细胞完整性的变化对于非临床药物开发具有重要意义。混合 96 孔细胞分析系统以实时和生理方式处理这两个参数，以获得可靠的、与人类相关的结果，这是安全过渡到临床阶段所必需的。
Abstract
心脏收缩力评估对于新疗法的开发及其安全过渡到临床阶段非常重要。虽然人类诱导的多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）有望在药物发现和安全药理学的临床前阶段作为人类相关模型，但它们的成熟度在科学界仍然存在争议，并且正在不断发展。我们提出了一种混合收缩性和阻抗/细胞外场电位（EFP）技术，为行业标准的96孔平台增加了重要的促成熟特征。
阻抗/EFP 系统实时监控蜂窝功能。除了收缩细胞的搏动率外，电阻抗谱读数还可以检测化合物诱导的形态变化，如细胞密度和细胞单层的完整性。在杂交细胞分析系统的另一个组件中，细胞在模拟真实心脏组织的机械环境的生物顺应性膜上培养。这种生理环境支持hiPSC-CMs在 体外成熟，导致更多的成人样收缩反应，包括用异丙肾上腺素，S-Bay K8644或奥卡替夫美卡比治疗后的正性肌力作用。收缩力振幅（mN/mm 2）和搏动持续时间等参数也揭示了化合物对电生理性能和钙处理影响的下游效应。
该混合系统为整体细胞分析提供了理想的工具，允许临床前心脏风险评估超越当前人类相关细胞测定的视角。
Introduction
现代药物开发的主要目标之一是提高药物发现管道中新疗法从实验室到床边的成功率。这些新药的安全性药理学测试通常揭示心血管系统的药物不良反应，几乎占临床前阶段药物损耗率的四分之一1。新方法（NAM）的开发和整合在临床前评估的现代化中发挥着关键作用，特别是心脏等核心电池器官。由于这些方法是无动物方法，因此在过去十年中，使用基于人类的细胞模型（如诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞（CMs））成为现代评估安全性药理学和毒理学问题的主力2。用于此类研究的广泛使用的测定系统是微电极阵列（MEA）和基于电压敏感染料的实验方法3。
然而，这种细胞类型声称的表型和功能不成熟性为理想的基于人类的细胞模型设置了障碍，有可能减少非临床和临床研究之间的翻译差距4。
多年来进行了大量研究，以了解隐含的未成熟表型的原因，并找到在 体外推动人类iPSC-CMs成熟过程的方法。
缺乏心脏成熟线索，例如延长的细胞培养时间，附近没有其他细胞类型或缺乏激素刺激，已被证明会影响成熟过程5。此外，由于天然人心脏缺少生理底物硬度，常规细胞培养板的非生理环境被确定为阻碍人类iPSC-CMs成熟的重要原因5，6。
为了解决这个问题，开发了专注于天然生理条件的不同测定系统，包括3D细胞培养系统，其中细胞在三维上排列以类似于天然心脏结构而不是典型的二维细胞培养物7。尽管通过3D测定可以提高成熟度，但对熟练劳动力的需求和这些系统的低通量阻碍了其在药物开发过程中的大量使用，因为时间和成本在财务层面评估新疗法中起着根本作用8。
新疗法的安全性药理学和毒理学评估的重要读数是人iPSC-CMs的功能和结构特征的变化，因为化合物诱导的心血管系统不良药物反应通常会影响这些特性中的一个或两个1，9。这种广泛不良反应的著名例子是蒽环类药物家族的抗癌药物。在这里，在患者癌症治疗期间和之后以及体外基于细胞的测定中，对心血管系统的危险功能和不良结构影响被广泛报道10，11。
在本研究中，我们描述了一种评估hiPSC-CMs的功能和结构化合物副作用的综合方法。该方法包括心肌细胞收缩力和阻抗/细胞外场电位（EFP）的分析。收缩力是在生理机械条件下测量的，细胞培养在柔软（33kPa）硅胶基质上，反映了天然人类心脏组织的机械环境。
该系统配备了 96 孔板，用于对人 iPSC-CM 进行高通量分析，用于临床前心脏安全性药理学和毒理学研究，因此为目前使用的 3D 方法（如 Langendorff 心脏或心脏切片12，13）提供了优势。
详细地说，混合系统由两个模块组成，用于评估生理条件下的心脏收缩力或实时细胞结构毒性分析6，14。两个模块均与专用的高通量 96 孔板配合使用，可实现快速且经济高效的数据采集。
无需3D结构，收缩性模块采用包含柔性有机硅膜的特殊板作为细胞基板，而不是常规细胞培养板通常由硬玻璃或塑料组成。这些膜反映了典型的人类生物力学心脏特性，因此以高通量的方式模拟 体内 条件。虽然人iPSC-CMs在其他基于细胞的测定中通常无法显示成人心肌细胞对化合物诱导的正性肌力的行为14，但当细胞在收缩模块的平板上培养时，可以评估更像成人的反应。在以前的研究中，已经证明iPSC-CMs在使用异丙肾上腺素，S-Bay K8644或奥卡替夫美卡比6，15等化合物处理时表现出积极的正性肌力作用。在这里，可以评估多个收缩力参数，例如收缩力振幅 （mN/mm 2）、搏动持续时间和搏动率等主要参数，以及收缩周期的次要参数，如曲线下面积、收缩和松弛斜率、搏动率变化和心律失常（补充图 1）16.通过电容式距离传感非侵入性评估药物诱导的所有参数的变化。原始数据随后由专门的软件进行分析。
结构毒性模块添加了其独特的阻抗和EFP参数，作为结构细胞毒性和电生理特性分析的读数17，18。电阻抗谱技术揭示了化合物诱导的细胞密度变化或实时监测的细胞和单层完整性，如用已知心脏毒性化合物处理的人 iPSC-CM 所示13。通过不同频率（1-100 kHz）的阻抗读数，可以进一步剖析生理反应，从而揭示膜形貌、细胞间或细胞-基质连接的变化。正如CiPA研究17，19所示，人iPSC-CMs的额外EFP记录进一步能够分析复合治疗引起的电生理效应。
在本研究中，使用人iPSC-CMs，用表柔比星和多柔比星（两者都被描述为心脏毒性蒽环类药物）和厄洛替尼（一种酪氨酸激酶抑制剂（TKI））治疗，心血管毒性风险相当低。使用表柔比星、多柔比星和厄洛替尼进行 5 天的慢性评估。结果显示，当细胞用厄洛替尼处理时，收缩力和碱基阻抗有微小变化，但分别用表柔比星和多柔比星处理时，收缩幅度和碱基阻抗的时间和剂量依赖性毒性降低。使用钙通道阻滞剂硝苯地平进行急性测量，显示收缩幅度、场电位持续时间和碱基阻抗降低，表明该化合物对功能和结构水平的心脏毒性副作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
阻抗/EFP/收缩力混合系统是一种综合方法，用于临床前药物开发的心脏负债的高通量安全性药理学和毒理学评估。它提供了一种现代的临床前安全性测试方法，无需使用动物模型，但具有更高的通量能力，可显着减少时间和成本。该系统有可能用作Langendorff心脏和其他动物模型的补充方法，用于临床前功能和结构毒性评估。
作为一种无动物的方法，人类iPSC-CMs被用于杂交系统<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了德国联邦经济事务和气候行动部（ZIM）和德国联邦教育与研究部（KMUinnovativ）的资助。我们感谢FUJIFILM Cellular Dynamics，Inc（美国威斯康星州麦迪逊）慷慨地提供心肌细胞，并感谢Ncardia B.V.（荷兰莱顿）慷慨地提供本研究中使用的心肌细胞。
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
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