Hybridcelleanalysesystem til vurdering af strukturelle og kontraktile ændringer af humane iPSC-afledte kardiomyocytter til præklinisk hjerterisikovurdering
Summary
Analysen af ændringer i kontraktil funktion og cellulær integritet af humane iPSC-afledte kardiomyocytter er af enorm betydning for udviklingen af ikke-kliniske lægemidler. Et hybrid 96-brønds celleanalysesystem adresserer begge parametre i realtid og fysiologisk for pålidelige, menneskerelevante resultater, der er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.
Abstract
Vurdering af hjertekontraktilitet er af enorm betydning for udviklingen af nye lægemidler og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) lover at tjene som en human-relevant model i prækliniske faser af lægemiddelopdagelse og sikkerhedsfarmakologi, er deres modenhed stadig kontroversiel i det videnskabelige samfund og under konstant udvikling. Vi præsenterer en hybrid kontraktilitets- og impedans/ekstracellulært feltpotentiale (EFP)-teknologi, der tilføjer betydelige pro-modningsfunktioner til en industristandard 96-brønds platform.
Impedans/EFP-systemet overvåger cellulær funktionalitet i realtid. Udover slaghastigheden for kontraktile celler registrerer de elektriske impedansspektroskopiudlæsninger sammensatte inducerede morfologiske ændringer som celletæthed og integritet af det cellulære monolag. I den anden komponent i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellerne på biokompatible membraner, der efterligner det mekaniske miljø i ægte hjertevæv. Dette fysiologiske miljø understøtter modningen af hiPSC-CM’er in vitro, hvilket fører til mere voksenlignende kontraktile reaktioner, herunder positive inotrope virkninger efter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametre som amplituden af kontraktionskraft (mN/mm2) og slagvarighed afslører også downstream-effekter af forbindelser med indflydelse på elektrofysiologiske egenskaber og calciumhåndtering.
Hybridsystemet giver det ideelle værktøj til holistisk celleanalyse, der muliggør præklinisk hjerterisikovurdering ud over de nuværende perspektiver for humanrelevante cellebaserede assays.
Introduction
Et af de vigtigste mål for moderne lægemiddeludvikling er at forbedre succesraten fra bænk til seng for nye lægemidler i lægemiddelopdagelsespipelinen. Sikkerhedsfarmakologisk afprøvning af disse nye lægemidler afslører ofte bivirkninger på det kardiovaskulære system, der tegner sig for næsten en fjerdedel af lægemiddelnedslidningshastigheden på prækliniske stadier1. Udviklingen og integrationen af nye tilgangsmetoder (NAMs) spiller en central rolle i moderniseringen af præklinisk vurdering, især kernebatteriorganer som hjertet. Da disse metoder er dyrefrie tilgange, er brugen af menneskebaserede cellemodeller som kardiomyocytter (CM’er) af induceret pluripotent stamcelleoprindelse (iPSC) blevet arbejdshesten i løbet af det sidste årti for den moderne vurdering af sikkerhedsfarmakologiske og toksikologiske spørgsmål2. Almindeligt anvendte analysesystemer til sådanne undersøgelser er mikroelektrodearray (MEA) og spændingsfølsomme farvestofbaserede eksperimentelle tilgange3.
Ikke desto mindre lægger den påståede fænotypiske og funktionelle umodenhed af denne celletype hindringer i vejen for en ideel menneskebaseret cellemodel med potentiale til at reducere translationelle huller mellem ikke-kliniske og kliniske undersøgelser4.
Enorm forskning er blevet udført gennem årene for at forstå årsagen til den underforståede umodne fænotype og for at finde måder at skubbe modningsprocessen af humane iPSC-CM’er in vitro.
Manglende hjertemodningssignaler såsom forlængede cellekulturtider, fravær af andre celletyper i nærheden eller mangel på hormonel stimulering viste sig at påvirke modningsprocessen5. Det ikke-fysiologiske miljø af regelmæssige cellekulturplader blev også identificeret som en væsentlig årsag, der hindrer modningen af humane iPSC-CM’er på grund af den manglende fysiologiske substratstivhed i det indfødte menneskelige hjerte 5,6.
Forskellige analysesystemer med fokus på indfødte fysiologiske forhold blev udviklet til at tackle dette problem, herunder 3D-cellekultursystemer, hvor celler justeres tredimensionelt for at ligne native hjertearkitektur i stedet for typiske todimensionelle cellekulturer7. Selv om der opnås forbedret modning med 3D-analyser, hæmmer behovet for en kvalificeret arbejdsstyrke og den lave gennemstrømning af disse systemer en rigelig anvendelse af dette i lægemiddeludviklingsprocessen, da tid og omkostninger spiller en grundlæggende rolle i vurderingen af nye behandlinger på et finansielt niveau8.
Vigtige aflæsninger til sikkerhedsfarmakologisk og toksikologisk vurdering af nye lægemidler er ændringer i funktionelle og strukturelle egenskaber ved humane iPSC-CM’er, da sammensatte inducerede bivirkninger i det kardiovaskulære system normalt påvirker en eller begge af disse egenskaber 1,9. Kendte eksempler på sådanne brede bivirkninger er anticancerlægemidler fra antracyklinfamilien. Her rapporteres farlige funktionelle og negative strukturelle virkninger på det kardiovaskulære system bredt under og efter kræftbehandling hos patienter samt med in vitro-cellebaserede assays10,11.
I denne undersøgelse beskriver vi en omfattende metode til vurdering af både funktionelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM’er. Metoden omfatter analyse af kardiomyocytkontraktil kraft og impedans / ekstracellulært feltpotentiale (EFP) analyse. Den kontraktile kraft måles under fysiologiske mekaniske forhold, hvor cellerne dyrkes på bløde (33 kPa) silikonesubstrater, hvilket afspejler det mekaniske miljø i naturligt humant hjertevæv.
Systemet er udstyret med 96-brøndsplader til analyse af høj kapacitet af humane iPSC-CM’er til prækliniske hjertesikkerhedsfarmakologiske og toksikologiske undersøgelser og giver dermed en fordel for aktuelt anvendte 3D-tilgange som Langendorff hjerte eller hjerteskiver12,13.
I detaljer består hybridsystemet af to moduler, enten til vurdering af hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse af cellulær strukturel toksicitet i realtid 6,14. Begge moduler arbejder med specialiserede 96-brøndsplader med høj kapacitet til hurtig og omkostningseffektiv dataindsamling.
Uden behov for en 3D-konstruktion anvender kontraktilitetsmodulet specialplader, der indeholder fleksible silikonemembraner som substrat for cellerne i stedet for det stive glas eller plast, som almindelige cellekulturplader normalt består af. Membranerne afspejler typiske humane biomekaniske hjerteegenskaber og efterligner derfor in vivo-forhold på en høj gennemstrømningsmåde. Mens humane iPSC-CM’er ofte ikke viser voksenkardiomyocytadfærd med hensyn til sammensat induceret positiv inotropi i andre cellebaserede assays14, kan en mere voksenlignende reaktion vurderes, når cellerne dyrkes på kontraktilitetsmodulets plader. I tidligere undersøgelser er det blevet påvist, at iPSC-CM’er udviser positive inotrope virkninger ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametre vurderes, såsom primære parametre som amplituden af kontraktionskraft (mN/mm2), slagvarighed og slaghastighed samt sekundære parametre for sammentrækningscyklussen som areal under kurven, sammentræknings- og afslapningshældninger, slaghastighedsvariationer og arytmier (supplerende figur 1)16 . Lægemiddelinducerede ændringer i alle parametre vurderes ikke-invasivt ved kapacitiv afstandsmåling. De rå data analyseres efterfølgende af specialiseret software.
Det strukturelle toksicitetsmodul tilføjer sine unikke impedans- og EFP-parametre som aflæsning for strukturel cellulær toksicitet og analyse af elektrofysiologiske egenskaber17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologi afslører forbindelsesinducerede ændringer i celletæthed eller celle- og monolagsintegritet overvåget i realtid, som vist med humane iPSC-CM’er behandlet med kendte kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansudlæsninger ved forskellige frekvenser (1-100 kHz) er det muligt at dissekere et fysiologisk respons yderligere, og dermed er det muligt at afsløre ændringer i membrantopografi, cellecelle- eller cellematrixkryds. Den yderligere EFP-registrering af humane iPSC-CM’er gør det yderligere muligt at analysere elektrofysiologiske virkninger fremkaldt ved sammensat behandling, som det blev vist i lyset af CiPA-undersøgelsen17,19.
I denne undersøgelse blev humane iPSC-CM’er anvendt, behandlet med epirubicin og doxorubicin, begge velbeskrevne som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehæmmer (TKI) med en ret lav risiko for kardiovaskulær toksicitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doxorubicin og erlotinib blev udført i 5 dage. Resultatet viser mindre ændringer i kontraktilitet og baseimpedans, når celler blev behandlet med erlotinib, men et tids- og dosisafhængigt toksisk fald i sammentrækningsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doxorubicin. Akutte målinger blev udført med calciumkanalblokker nifedipin og viser et fald i sammentrækningsamplitude, feltpotentiel varighed og baseimpedans, hvilket viser kardiotoksiske bivirkninger af denne forbindelse på funktionelle såvel som strukturelle niveauer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metode til sikkerhed, farmakologisk og toksikologisk vurdering af hjerteansvar for præklinisk lægemiddeludvikling med høj kapacitet. Det giver en moderne tilgang til præklinisk sikkerhedstest uden brug af dyremodeller, men med højere gennemløbskapacitet, der reducerer tid og omkostninger betydeligt. Dette system har potentiale til at blive brugt som en komplementær tilgang til Langendorff Heart og andre dyremodeller til præklinisk funktionel og strukture…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det tyske forbundsministerium for økonomi og klima (ZIM) og fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for venligt at levere kardiomyocytter og Ncardia BV (Leiden, Holland) for venligt at levere kardiomyocytter, der anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
