Hybride celanalysesysteem om structurele en contractiele veranderingen van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen voor preklinische cardiale risico-evaluatie
Summary
De analyse van veranderingen in contractiele functie en cellulaire integriteit van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten is van immens belang voor de ontwikkeling van niet-klinische geneesmiddelen. Een hybride 96-well celanalysesysteem behandelt beide parameters op een real-time en fysiologische manier voor betrouwbare, voor de mens relevante resultaten, die nodig zijn voor een veilige overgang naar klinische stadia.
Abstract
Cardiale contractiliteitsbeoordeling is van immens belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën en hun veilige overgang naar klinische stadia. Hoewel door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM’s) veelbelovend zijn om te dienen als een voor de mens relevant model in preklinische fasen van geneesmiddelenontdekking en veiligheidsfarmacologie, is hun volwassenheid nog steeds controversieel in de wetenschappelijke gemeenschap en in constante ontwikkeling. We presenteren een hybride contractiliteit en impedantie/extracellulair veldpotentieel (EFP) technologie, die aanzienlijke pro-rijpingsfuncties toevoegt aan een industriestandaard 96-well platform.
Het impedantie/EFP-systeem bewaakt de cellulaire functionaliteit in realtime. Naast de slagsnelheid van contractiele cellen, detecteren de elektrische impedantiespectroscopie-uitlezingen door verbindingen geïnduceerde morfologische veranderingen zoals celdichtheid en integriteit van de cellulaire monolaag. In het andere onderdeel van het hybride celanalysesysteem worden de cellen gekweekt op bioconforme membranen die de mechanische omgeving van echt hartweefsel nabootsen. Deze fysiologische omgeving ondersteunt de rijping van hiPSC-CMs in vitro, wat leidt tot meer volwassen-achtige contractiele reacties, waaronder positieve inotrope effecten na behandeling met isoproterenol, S-Bay K8644 of omecamtiv mecarbil. Parameters zoals de amplitude van de contractiekracht (mN/mm2) en de beatduur onthullen ook stroomafwaartse effecten van verbindingen met invloed op elektrofysiologische eigenschappen en calciumbehandeling.
Het hybride systeem biedt het ideale hulpmiddel voor holistische celanalyse, waardoor preklinische cardiale risicobeoordeling mogelijk is die verder gaat dan de huidige perspectieven van voor mensen relevante celgebaseerde testen.
Introduction
Een van de belangrijkste doelen van de ontwikkeling van moderne geneesmiddelen is de verbetering van het succespercentage van nieuwe therapieën in de pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Veiligheidsfarmacologische tests van deze nieuwe geneesmiddelen onthullen vaak bijwerkingen op het cardiovasculaire systeem die goed zijn voor bijna een kwart van het verloop van geneesmiddelen in preklinische stadia1. De ontwikkeling en integratie van nieuwe benaderingsmethodologieën (NAMs) spelen een sleutelrol bij de modernisering van preklinische beoordeling, in het bijzonder kernbatterijorganen zoals het hart. Aangezien deze methodologieën diervrije benaderingen zijn, werd het gebruik van op mensen gebaseerde celmodellen zoals cardiomyocyten (CM’s) van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) oorsprong het afgelopen decennium het werkpaard voor de moderne beoordeling van veiligheidsfarmacologische en toxicologische kwesties2. Veelgebruikte testsystemen voor dergelijke onderzoeken zijn micro-elektrode array (MEA) en spanningsgevoelige kleurstof-gebaseerde experimentele benaderingen3.
Niettemin plaatst de geclaimde fenotypische en functionele onvolwassenheid van dit celtype obstakels in de weg van een ideaal op mensen gebaseerd celmodel, met het potentieel om translationele hiaten tussen niet-klinische en klinische studies te verminderen4.
In de loop der jaren is er enorm veel onderzoek gedaan om de reden voor het impliciete onrijpe fenotype te begrijpen en manieren te vinden om het rijpingsproces van menselijke iPSC-CMs in vitro te pushen.
Het ontbreken van hartrijpingssignalen zoals langdurige celkweektijden, een afwezigheid van andere celtypen in de buurt of een gebrek aan hormonale stimulatie bleek het rijpingsproces te beïnvloeden5. Ook werd de niet-fysiologische omgeving van reguliere celkweekplaten geïdentificeerd als een belangrijke oorzaak die de rijping van menselijke iPSC-CM’s belemmert, vanwege de ontbrekende fysiologische substraatstijfheid van het inheemse menselijke hart 5,6.
Verschillende testsystemen met een focus op inheemse fysiologische omstandigheden werden ontwikkeld om dit probleem aan te pakken, waaronder 3D-celkweeksystemen waarbij cellen driedimensionaal worden uitgelijnd om te lijken op inheemse cardiale architectuur in plaats van typische tweedimensionale celculturen7. Hoewel verbeterde rijping wordt verkregen met 3D-assays, belemmert de behoefte aan geschoolde arbeidskrachten en de lage doorvoer van deze systemen een overvloedig gebruik hiervan in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, aangezien tijd en kosten een fundamentele rol spelen bij de beoordeling van nieuwe therapieën op financieel niveau8.
Belangrijke uitlezingen voor de farmacologische en toxicologische beoordeling van nieuwe therapieën zijn veranderingen in functionele en structurele kenmerken van humane iPSC-CMs, aangezien door verbindingen geïnduceerde bijwerkingen van het cardiovasculaire systeem meestal een of beide van deze eigenschappen beïnvloeden 1,9. Bekende voorbeelden van dergelijke brede bijwerkingen zijn geneesmiddelen tegen kanker van de anthracyclinefamilie. Hier worden gevaarlijke functionele en nadelige structurele effecten op het cardiovasculaire systeem op grote schaal gemeld tijdens en na de behandeling van kanker bij patiënten, evenals met in vitro celgebaseerde assays10,11.
In deze studie beschrijven we een uitgebreide methodologie voor de beoordeling van zowel functionele als structurele samengestelde bijwerkingen op hiPSC-CMs. De methodologie omvat de analyse van cardiomyocytencontractiele kracht en impedantie / extracellulaire veldpotentiaal (EFP) analyse. De contractiele kracht wordt gemeten onder fysiologische mechanische omstandigheden, waarbij de cellen worden gekweekt op zachte (33 kPa) siliconensubstraten, die de mechanische omgeving van het inheemse menselijke hartweefsel weerspiegelen.
Het systeem is uitgerust met 96-well platen voor high throughput analyse van humane iPSC-CMs voor preklinische cardiale veiligheid farmacologische en toxicologische studies, en biedt dus een voordeel ten opzichte van momenteel gebruikte 3D-benaderingen zoals Langendorff hart of hart plakjes12,13.
In detail bestaat het hybride systeem uit twee modules, hetzij voor de beoordeling van cardiale contractiliteit onder fysiologische omstandigheden, hetzij voor de analyse van real-time cellulaire structurele toxiciteit 6,14. Beide modules werken met gespecialiseerde 96-well platen met hoge doorvoer voor snelle en kosteneffectieve gegevensverzameling.
Zonder de noodzaak van een 3D-constructie, maakt de contractiliteitsmodule gebruik van speciale platen die flexibele siliconenmembranen bevatten als substraat voor de cellen in plaats van het stijve glas of plastic waaruit reguliere celkweekplaten meestal bestaan. De membranen weerspiegelen typische menselijke biomechanische harteigenschappen en bootsen daarom in vivo omstandigheden na op een manier met een hoge doorvoer. Hoewel menselijke iPSC-CM’s vaak geen volwassen cardiomyocytengedrag vertonen met betrekking tot door verbindingen geïnduceerde positieve inotropie in andere celgebaseerde assays14, kan een meer volwassen-achtige reactie worden beoordeeld wanneer de cellen worden gekweekt op de platen van de contractiliteitsmodule. In eerdere studies is aangetoond dat iPSC-CM’s positieve inotrope effecten vertonen bij behandeling met verbindingen zoals isoproterenol, S-Bay K8644 of omecamtiv mecarbil 6,15. Hier kunnen meerdere contractiliteitsparameters worden beoordeeld, zoals primaire parameters zoals de amplitude van contractiekracht (mN / mm2), beatduur en beatsnelheid, evenals secundaire parameters van de contractiecyclus zoals gebied onder de curve, contractie- en ontspanningshellingen, beat rate-variaties en aritmieën (aanvullende figuur 1) 16 . Geneesmiddel-geïnduceerde veranderingen in alle parameters worden niet-invasief beoordeeld door capacitieve afstandsdetectie. De ruwe data wordt vervolgens geanalyseerd door gespecialiseerde software.
De structurele toxiciteitsmodule voegt zijn unieke impedantie- en EFP-parameters toe als een uitlezing voor structurele cellulaire toxiciteit en de analyse van elektrofysiologische eigenschappen17,18. De elektrische impedantiespectroscopietechnologie onthult samengestelde veranderingen in celdichtheid of cel- en monolaagintegriteit die in realtime wordt bewaakt, zoals aangetoond met menselijke iPSC-CM’s die zijn behandeld met bekende cardiotoxische verbindingen13. Met impedantie-uitlezingen op verschillende frequenties (1-100 kHz) is het mogelijk om een fysiologische respons verder te ontleden, en zo is het onthullen van veranderingen in membraantopografie, cel-cel of cel-matrix juncties haalbaar. De aanvullende EFP-registratie van humane iPSC-CM’s maakt verder de analyse mogelijk van elektrofysiologische effecten die worden veroorzaakt door samengestelde behandeling, zoals werd aangetoond in het licht van de CiPA-studie17,19.
In deze studie werden humane iPSC-CMs gebruikt, behandeld met epirubicine en doxorubicine, beide goed beschreven als cardiotoxische anthracyclines, en erlotinib, een tyrosinekinaseremmer (TKI) met een vrij laag risico op cardiovasculaire toxiciteit. Chronische beoordeling met epirubicine, doxorubicine en erlotinib werd gedurende 5 dagen uitgevoerd. Het resultaat toont kleine veranderingen in contractiliteit en base impedantie wanneer cellen werden behandeld met erlotinib, maar een tijd- en dosisafhankelijke toxische afname van contractieamplitude en base impedantie bij behandeling met respectievelijk epirubicine en doxorubicine. Acute metingen werden uitgevoerd met calciumantagonist nifedipine en tonen een afname van de amplitude van de contractie, de duur van het veldpotentiaal en de basisimpedantie, wat cardiotoxische bijwerkingen van deze verbinding op zowel functioneel als structureel niveau aantoont.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het impedantie/FPW/contractiliteit hybride systeem is een uitgebreide methodologie voor high throughput veiligheid farmacologische en toxicologische beoordeling van cardiale aansprakelijkheden voor preklinische geneesmiddelenontwikkeling. Het biedt een moderne aanpak voor preklinische veiligheidstests zonder het gebruik van diermodellen, maar met hogere doorvoermogelijkheden die tijd en kosten aanzienlijk verminderen. Dit systeem heeft het potentieel om te worden gebruikt als een aanvullende benadering voor het Langendor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Duitse federale ministerie van Economische Zaken en Klimaatactie (ZIM) en van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (KMUinnovativ). Wij danken FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) voor het verstrekken van cardiomyocyten en Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) voor het vriendelijk verstrekken van cardiomyocyten, gebruikt in deze studie.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
