מערכת ניתוח תאים היברידית להערכת שינויים מבניים והתכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי להערכת סיכון לבבי פרה-קליני
Summary
ניתוח השינויים בתפקוד ההתכווצות ובשלמות התאים של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי הוא בעל חשיבות עצומה לפיתוח תרופות לא קליניות. מערכת היברידית של 96 תאים מטפלת בשני הפרמטרים בזמן אמת ובאופן פיזיולוגי לקבלת תוצאות אמינות ורלוונטיות לבני אדם, הנחוצות למעבר בטוח לשלבים קליניים.
Abstract
הערכת התכווצות הלב היא בעלת חשיבות עצומה לפיתוח טיפולים חדשים ומעברם הבטוח לשלבים קליניים. בעוד שקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) מבטיחים לשמש כמודל רלוונטי לאדם בשלבים פרה-קליניים של גילוי תרופות ופרמקולוגיה בטיחותית, בגרותם עדיין שנויה במחלוקת בקהילה המדעית ובפיתוח מתמיד. אנו מציגים טכנולוגיית התכווצות היברידית ועכבה/פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP), ומוסיפים תכונות פרו-התבגרות משמעותיות לפלטפורמה 96-well-well בתקן התעשייה.
מערכת העכבה/EFP מנטרת את הפונקציונליות התאית בזמן אמת. מלבד קצב הפעימה של תאים מתכווצים, קריאות ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית מזהות שינויים מורפולוגיים הנגרמים על-ידי תרכובת, כמו צפיפות התאים ותקינות המונו-שכבתי התאית. במרכיב השני של מערכת ניתוח התאים ההיברידית, התאים מגודלים בתרבית על גבי ממברנות תואמות ביולוגית המחקות את הסביבה המכנית של רקמת לב אמיתית. סביבה פיזיולוגית זו תומכת בהבשלה של hiPSC-CMs במבחנה, מה שמוביל לתגובות התכווצות דמויות מבוגרים יותר, כולל השפעות אינוטרופיות חיוביות לאחר טיפול באיזופרוטרנול, S-Bay K8644 או omecamtiv mecarbil. פרמטרים כגון משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2) ומשך הפעימה חושפים גם הם השפעות במורד הזרם של תרכובות בעלות השפעה על תכונות אלקטרופיזיולוגיות וטיפול בסידן.
המערכת ההיברידית מספקת את הכלי האידיאלי לניתוח תאים הוליסטי, ומאפשרת הערכת סיכון לבבי פרה-קלינית מעבר לפרספקטיבות הנוכחיות של מבחנים מבוססי תאים רלוונטיים לבני אדם.
Introduction
אחת המטרות העיקריות של פיתוח תרופות מודרניות היא שיפור שיעור ההצלחה מספסל למיטה של טיפולים חדשים בצנרת גילוי התרופות. בדיקות פרמקולוגיות בטיחותיות של תרופות חדשות אלה מגלות לעתים קרובות תגובות שליליות של תרופות במערכת הלב וכלי הדם, המהוות כמעט רבע משיעור ההתשה של התרופה בשלבים פרה-קליניים1. הפיתוח והאינטגרציה של מתודולוגיות גישה חדשות (NAMs) ממלאים תפקיד מפתח במודרניזציה של הערכה פרה-קלינית, במיוחד איברי סוללות ליבה כמו הלב. מאחר שמתודולוגיות אלה הן גישות נטולות בעלי חיים, השימוש במודלים של תאים מבוססי אדם כמו קרדיומיוציטים (CMs) ממוצא תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הפך לסוס העבודה בעשור האחרון עבור ההערכה המודרנית של סוגיות פרמקולוגיות וטוקסיקולוגיות בטיחותיות2. מערכות בדיקה הנמצאות בשימוש נרחב עבור חקירות כאלה הן מערך מיקרואלקטרודות (MEA) וגישות ניסיוניות מבוססות צבע רגישות למתח3.
אף על פי כן, חוסר הבשלות הפנוטיפית והתפקודית הנטענת של סוג תא זה מציב מכשולים בדרכו של מודל תא אידיאלי המבוסס על בני אדם, עם פוטנציאל לצמצם פערים תרגומיים בין מחקרים לא קליניים וקליניים4.
מחקר עצום נערך לאורך השנים כדי להבין את הסיבה לפנוטיפ הלא בוגר המשתמע ולמצוא דרכים לדחוף את תהליך ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים במבחנה.
בהיעדר רמזי התבגרות לבביים כגון זמני תרבית תאים ממושכים, היעדר סוגי תאים אחרים בסביבה או היעדר גירוי הורמונלי הודגם כמשפיעים על תהליך ההבשלה5. כמו כן, הסביבה הלא פיזיולוגית של צלחות תרבית תאים רגילות זוהתה כגורם משמעותי המעכב את ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים, בשל נוקשות המצע הפיזיולוגי החסר של הלב האנושי המקומי 5,6.
מערכות בדיקה שונות עם דגש על תנאים פיזיולוגיים מקומיים פותחו כדי להתמודד עם בעיה זו, כולל מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות שבהן התאים מיושרים באופן תלת-ממדי כדי להידמות לארכיטקטורת הלב המקומית במקום לתרביות תאים דו-ממדיות טיפוסיות7. למרות שהתבגרות משופרת מתקבלת באמצעות בדיקות תלת-ממדיות, הצורך בכוח עבודה מיומן והתפוקה הנמוכה של מערכות אלה מעכבים שימוש רב בכך בתהליך פיתוח התרופות, שכן הזמן והעלות ממלאים תפקיד בסיסי בהערכת טיפולים חדשים ברמה הפיננסית8.
קריאות חשובות להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית בטיחותית של טיפולים חדשים הן שינויים במאפיינים תפקודיים ומבניים של iPSC-CMs אנושיים, שכן תגובות שליליות הנגרמות על ידי תרכובות של מערכת הלב וכלי הדם משפיעות בדרך כלל על אחד או שניהם ממאפיינים אלה 1,9. דוגמאות ידועות לתגובות שליליות רחבות כאלה הן תרופות אנטי סרטניות ממשפחת האנתרציקלין. כאן, השפעות תפקודיות ומבניות שליליות מסוכנות על מערכת הלב וכלי הדם מדווחות באופן נרחב במהלך ואחרי טיפול בסרטן בחולים, כמו גם עם בדיקות מבוססות תאי מבחנה 10,11.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה להערכת תופעות לוואי של תרכובות פונקציונליות ומבניות על hiPSC-CMs. המתודולוגיה כוללת ניתוח של כוח התכווצות קרדיומיוציטים וניתוח עכבה / פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP). כוח ההתכווצות נמדד בתנאים מכניים פיזיולוגיים, כאשר התאים מתרבית על מצעי סיליקון רכים (33 kPa), המשקפים את הסביבה המכנית של רקמת הלב האנושית המקומית.
המערכת מצוידת בלוחות 96 באר לניתוח תפוקה גבוהה של iPSC-CMs אנושיים למחקרים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים פרה-קליניים לבטיחות לב, ובכך מספקת יתרון לגישות תלת-ממדיות המשמשות כיום כמו לנגנדורף לב או פרוסות לב12,13.
בפירוט, המערכת ההיברידית מורכבת משני מודולים, או להערכת התכווצות הלב בתנאים פיזיולוגיים או לניתוח רעילות מבנית תאית בזמן אמת 6,14. שני המודולים עובדים עם לוחות מיוחדים בעלי תפוקה גבוהה של 96 בארות להשגת נתונים מהירה וחסכונית.
ללא צורך במבנה תלת-ממדי, מודול ההתכווצות משתמש בלוחות מיוחדים המכילים קרומי סיליקון גמישים כמצע לתאים במקום הזכוכית הנוקשה או הפלסטיק שמהם מורכבות בדרך כלל לוחות תרבית תאים רגילים. הממברנות משקפות תכונות לב ביומכניות אנושיות טיפוסיות ולכן מחקות תנאי in vivo באופן בעל תפוקה גבוהה. בעוד ש-iPSC-CMs אנושיים נכשלים לעתים קרובות בהצגת התנהגות קרדיומיוציטים של מבוגרים בנוגע לאינוטרופיה חיובית הנגרמת על-ידי תרכובות במבחנים אחרים המבוססים על תאים14, ניתן להעריך תגובה דמוית מבוגר יותר כאשר התאים מתרבית על הלוחות של מודול ההתכווצות. במחקרים קודמים, הוכח כי iPSC-CMs מציגים השפעות אינוטרופיות חיוביות על טיפול בתרכובות כגון איזופרוטרנול, S-Bay K8644, או omecamtiv mecarbil 6,15. כאן ניתן להעריך פרמטרים רבים של התכווצות, כגון פרמטרים ראשוניים כמו משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2), משך פעימה וקצב פעימה, כמו גם פרמטרים משניים של מחזור הכיווץ כמו שטח מתחת לעקומה, מדרונות כיווץ והרפיה, וריאציות קצב פעימה והפרעות קצב (איור משלים 1)16 . שינויים הנגרמים על ידי תרופות בכל הפרמטרים מוערכים באופן לא פולשני על ידי חישת מרחק קיבולית. הנתונים הגולמיים מנותחים לאחר מכן על ידי תוכנה מיוחדת.
מודול הרעילות המבנית מוסיף את העכבה הייחודית שלו ואת פרמטרי EFP כקריאה לרעילות תאית מבנית ולניתוח תכונות אלקטרופיזיולוגיות17,18. טכנולוגיית ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית חושפת שינויים המושרים על-ידי תרכובות בצפיפות התא או בתקינות התא והחד-שכבתית המנוטרים בזמן אמת, כפי שמוצג עם iPSC-CMs אנושיים שטופלו בתרכובות קרדיוטוקסיות ידועות13. עם קריאות עכבה בתדרים שונים (1-100 קילוהרץ) ניתן לנתח תגובה פיזיולוגית נוספת, וכך ניתן להשיג שינויים בטופוגרפיה של הממברנה, תא-תא או צמתים של מטריצת תא. הקלטת ה-EFP הנוספת של iPSC-CMs אנושיים מאפשרת גם ניתוח של השפעות אלקטרופיזיולוגיות הנגרמות על ידי טיפול תרכובת, כפי שהוכח לאור מחקר CiPA17,19.
במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-iPSC-CMs אנושיים, שטופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין, שניהם מתוארים היטב כאנתרציקלין קרדיוטוקסי, וארלוטיניב, מעכב טירוזין קינאז (TKI) עם סיכון נמוך למדי לרעילות לב וכלי דם. הערכה כרונית עם אפירוביצין, דוקסורוביצין וארלוטיניב בוצעה במשך 5 ימים. התוצאה מראה שינויים קלים בהתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר תאים טופלו בארלוטיניב, אך ירידה רעילה תלוית זמן ומינון במשרעת ההתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר טופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין בהתאמה. מדידות חריפות בוצעו עם חוסם תעלות הסידן ניפדיפין והראו ירידה באמפליטודת הכיווץ, משך פוטנציאל השדה ועכבת הבסיס, מה שהדגים תופעות לוואי קרדיוטוקסיות של תרכובת זו ברמה התפקודית כמו גם המבנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המערכת ההיברידית עכבה / EFP / התכווצות היא מתודולוגיה מקיפה להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית של בטיחות תפוקה גבוהה של התחייבויות לב לפיתוח תרופות פרה-קליניות. הוא מספק גישה מודרנית לבדיקות בטיחות פרה-קליניות ללא שימוש במודלים של בעלי חיים, אך עם יכולות תפוקה גבוהות יותר המפחיתות באופן משמע?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמשרד הפדרלי הגרמני לענייני כלכלה ופעולה אקלימית (צים) וממשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (KMUinnovativ). אנו מודים ל- FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (מדיסון, ויסקונסין, ארה”ב) על כך שסיפקה בחביבות קרדיומיוציטים ו- Ncardia B.V. (ליידן, הולנד) על אספקת קרדיומיוציטים בחביבות, המשמשים במחקר זה.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
