Summary

Modellering van menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro in 2D-structuur

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Het huidige protocol verklaart de generatie van een 2D-monolaag van cerebellaire cellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het onderzoeken van de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling.

Abstract

De precieze en tijdige ontwikkeling van het cerebellum is niet alleen cruciaal voor een nauwkeurige motorische coördinatie en balans, maar ook voor cognitie. Bovendien is verstoring van de cerebellaire ontwikkeling betrokken bij veel neurologische ontwikkelingsstoornissen, waaronder autisme, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) en schizofrenie. Onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling bij mensen was voorheen alleen mogelijk door postmortale studies of neuroimaging, maar deze methoden zijn niet voldoende om de moleculaire en cellulaire veranderingen te begrijpen die in vivo optreden tijdens de vroege ontwikkeling, wanneer veel neurologische ontwikkelingsstoornissen ontstaan. De opkomst van technieken om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) te genereren uit somatische cellen en het vermogen om iPSC’s verder te differentiëren in neuronen hebben de weg vrijgemaakt voor in vitro modellering van vroege hersenontwikkeling. De huidige studie biedt vereenvoudigde stappen in de richting van het genereren van cerebellaire cellen voor toepassingen die een 2-dimensionale (2D) monolaagstructuur vereisen. Cerebellaire cellen die vroege ontwikkelingsstadia vertegenwoordigen, worden afgeleid van menselijke iPSC’s via de volgende stappen: ten eerste worden embryoïde lichamen gemaakt in 3-dimensionale (3D) cultuur, vervolgens worden ze behandeld met FGF2 en insuline om cerebellaire lotspecificatie te bevorderen, en ten slotte worden ze terminaal gedifferentieerd als een monolaag op poly-l-ornithine (PLO) / laminine-gecoate substraten. Na 35 dagen differentiatie drukken iPSC-afgeleide cerebellaire celculturen cerebellaire markers uit, waaronder ATOH1, PTF1α, PAX6 en KIRREL2, wat suggereert dat dit protocol glutamaterge en GABAerge cerebellaire neuronale voorlopers genereert, evenals Purkinje-celvoorlopers. Bovendien vertonen de gedifferentieerde cellen een duidelijke neuronale morfologie en zijn ze positief voor immunofluorescentiemarkers van neuronale identiteit zoals TUBB3. Deze cellen drukken axonale geleidingsmoleculen uit, waaronder semafoor-4C, plexine-B2 en neuropiline-1, en kunnen dienen als een model voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van neurietuitgroei en synaptische connectiviteit. Deze methode genereert menselijke cerebellaire neuronen die nuttig zijn voor downstream-toepassingen, waaronder genexpressie, fysiologische en morfologische studies die 2D-monolaagformaten vereisen.

Introduction

Het begrijpen van de ontwikkeling van menselijke cerebellen en de kritieke tijdvensters van dit proces is niet alleen belangrijk voor het decoderen van de mogelijke oorzaken van neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar ook voor het identificeren van nieuwe doelen voor therapeutische interventie. Het modelleren van de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro is een uitdaging geweest, maar in de loop van de tijd zijn er veel protocollen ontstaan die menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of iPSC’s met cerebellaire afstammingsnadommen onderscheiden 1,2,3,4,5,6,7,8 . Verder is het belangrijk om protocollen te ontwikkelen die reproduceerbare resultaten genereren, relatief eenvoudig zijn (om fouten te verminderen) en niet zwaar zijn voor de geldkosten.

De eerste protocollen voor cerebellaire differentiatie werden gegenereerd uit 2D-culturen van vergulde embryoïde lichamen (EV’s), waardoor cerebellair lot werd geïnduceerd met verschillende groeifactoren vergelijkbaar met in vivo ontwikkeling, waaronder WNT, BMP’s en FFGF’s 1,9. Meer recent gepubliceerde protocollen induceerden differentiatie voornamelijk in 3D organoïde cultuur met FGF2 en insuline, gevolgd door FGF19 en SDF1 voor rhombische lipachtige structuren 3,4, of gebruikten een combinatie van FGF2, FGF4 en FGF85. Beide cerebellaire organoïde inductiemethoden resulteerden in vergelijkbare 3D cerebellaire organoïden, aangezien beide protocollen vergelijkbare cerebellaire markerexpressie op identieke tijdstippen rapporteerden. Holmes en Heine breidden hun 3D-protocol5 uit om aan te tonen dat 2D-cerebellaire cellen kunnen worden gegenereerd uit hESCs en iPSC’s, die beginnen als 3D-aggregaten. Bovendien toonden Silva et al.7 aan dat cellen die volwassen cerebellaire neuronen in 2D vertegenwoordigen, kunnen worden gegenereerd met een vergelijkbare benadering als Holmes en Heine, waarbij een ander tijdspunt wordt gebruikt om over te schakelen van 3D naar 2D en de tijd van groei en rijping wordt verlengd.

Het huidige protocol induceert het lot van cerebellair in feedervrije iPSC’s door vrij zwevende embryoïde lichamen (EVB’s) te genereren met behulp van insuline en FGF2 en vervolgens de EB’s op PLO / laminine-gecoate gerechten op dag 14 te plaatsen voor 2D-groei en differentiatie. Op dag 35 worden cellen met cerebellaire identiteit verkregen. Het vermogen om de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling samen te vatten, vooral in een 2D-omgeving, stelt onderzoekers in staat om specifieke vragen te beantwoorden die experimenten met een monolaagstructuur vereisen. Dit protocol is ook vatbaar voor verdere wijzigingen zoals microverwerkte oppervlakken, axonale uitgroeitests en celsortering om de gewenste celpopulaties te verrijken.

Protocol

Het onderzoek naar menselijke proefpersonen werd goedgekeurd onder het goedkeuringsnummer 201805995 van de University of Iowa Institutional Review Board en het goedkeuringsnummer 2017-02 van de Human Pluripotent Stem Cell Committee van de Universiteit van Iowa. Huidbiopten werden verkregen van de proefpersonen na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming. De fibroblasten werden gekweekt in DMEM met 15% foetaal runderserum (FBS) en 1% MEM-niet-essentiële aminozurenoplossing bij 37 °C en 5% CO2</su…

Representative Results

Overzicht van de 3D naar 2D cerebellaire differentiatieCerebellaire cellen worden gegenereerd vanaf iPSC’s. Figuur 1A toont de algehele workflow en de toevoeging van belangrijke componenten voor differentiatie. Op dag 0 worden EB’s gemaakt door de iPSC-kolonies voorzichtig op te tillen (figuur 1B) met behulp van een getrokken glazen pipet in CDM met SB431542 en Y-27632 en in ultralage bevestigingsplaten te plaatsen. FGF2 wordt toegevoegd op …

Discussion

Het vermogen om de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro te modelleren is belangrijk voor ziektemodellering en het bevorderen van het begrip van normale hersenontwikkeling. Minder gecompliceerde en kosteneffectieve protocollen creëren meer mogelijkheden voor het genereren van repliceerbare gegevens en brede implementatie in meerdere wetenschappelijke laboratoria. Een cerebellair differentiatieprotocol wordt hier beschreven met behulp van een aangepaste methode voor het genereren van EB’s die geen enzyme…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Jenny Gringer Richards voor haar grondige werk bij het valideren van onze controlepersonen, waaruit we de controle-iPSC’s hebben gegenereerd. Dit werk werd ondersteund door NIH T32 MH019113 (aan D.A.M. en K.A.K.), de Nellie Ball Trust (aan T.H.W. en A.J.W.), NIH R01 MH111578 (aan V.A.M. en J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (aan A.J.W.), en de Roy J. Carver Charitable Trust (aan V.A.M., J.A.W., en A.J.W.). De figuren zijn gemaakt met BioRender.com.

Materials

10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum – Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90×250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Biologie du développement. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Play Video

Citer Cet Article
Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

View Video