Modellazione dello sviluppo cerebellare umano in vitro nella struttura 2D
Summary
Il presente protocollo spiega la generazione di un monostrato 2D di cellule cerebellari da cellule staminali pluripotenti indotte per studiare le prime fasi dello sviluppo cerebellare.
Abstract
Lo sviluppo preciso e tempestivo del cervelletto è fondamentale non solo per un’accurata coordinazione motoria e l’equilibrio, ma anche per la cognizione. Inoltre, l’interruzione dello sviluppo cerebellare è stata implicata in molti disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui l’autismo, il disturbo da deficit di attenzione-iperattività (ADHD) e la schizofrenia. Le indagini sullo sviluppo cerebellare negli esseri umani sono state precedentemente possibili solo attraverso studi post-mortem o neuroimaging, ma questi metodi non sono sufficienti per comprendere i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano in vivo durante lo sviluppo precoce, che è quando hanno origine molti disturbi dello sviluppo neurologico. L’emergere di tecniche per generare cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) da cellule somatiche e la capacità di ridifferenziare ulteriormente le iPSC in neuroni hanno spianato la strada alla modellazione in vitro dello sviluppo precoce del cervello. Il presente studio fornisce passaggi semplificati verso la generazione di cellule cerebellari per applicazioni che richiedono una struttura monostrato 2-dimensionale (2D). Le cellule cerebellari che rappresentano le prime fasi di sviluppo sono derivate dalle iPSC umane attraverso le seguenti fasi: in primo luogo, i corpi embrioidi sono realizzati in coltura 3-dimensionale (3D), quindi sono trattati con FGF2 e insulina per promuovere la specifica del destino cerebellare e, infine, sono differenziati terminalmente come monostrato su substrati rivestiti di poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A 35 giorni di differenziazione, le colture cellulari cerebellari derivate da iPSC esprimono marcatori cerebellari tra cui ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, suggerendo che questo protocollo genera precursori neuronali cerebellari glutammatergici e GABAergici, nonché progenitori delle cellule di Purkinje. Inoltre, le cellule differenziate mostrano una morfologia neuronale distinta e sono positive per marcatori di immunofluorescenza dell’identità neuronale come TUBB3. Queste cellule esprimono molecole guida assonali, tra cui semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e potrebbero servire come modello per studiare i meccanismi molecolari della crescita dei neuriti e della connettività sinaptica. Questo metodo genera neuroni cerebellari umani utili per applicazioni a valle, tra cui studi di espressione genica, fisiologici e morfologici che richiedono formati monostrato 2D.
Introduction
Comprendere lo sviluppo cerebellare umano e le finestre temporali critiche di questo processo è importante non solo per decodificare le possibili cause dei disturbi dello sviluppo neurologico, ma anche per identificare nuovi bersagli per l’intervento terapeutico. La modellazione dello sviluppo cerebellare umano in vitro è stata impegnativa, ma nel tempo sono emersi molti protocolli che differenziano le cellule staminali embrionali umane (hESC) o iPSC con i destini della linea cerebellare 1,2,3,4,5,6,7,8 . Inoltre, è importante sviluppare protocolli che generino risultati riproducibili, siano relativamente semplici (per ridurre l’errore) e non siano pesanti sui costi monetari.
I primi protocolli per la differenziazione cerebellare sono stati generati da colture 2D da corpi embrioidi placcati (EB), inducendo il destino cerebellare con vari fattori di crescita simili allo sviluppo in vivo, tra cui WNT, BMP e FGF 1,9. Protocolli pubblicati più recenti hanno indotto la differenziazione principalmente nella coltura di organoidi 3D con FGF2 e insulina, seguita da FGF19 e SDF1 per strutture rombiche simili a labbro3,4, o utilizzato una combinazione di FGF2, FGF4 e FGF85. Entrambi i metodi di induzione degli organoidi cerebellari hanno portato a organoidi cerebellari 3D simili poiché entrambi i protocolli hanno riportato un’espressione di marcatori cerebellari simili in punti temporali identici. Holmes e Heine hanno esteso il loro protocollo 3D5 per dimostrare che le cellule cerebellari 2D possono essere generate da hESC e iPSC, che iniziano come aggregati 3D. Inoltre, Silva et al.7 hanno dimostrato che le cellule che rappresentano i neuroni cerebellari maturi in 2D possono essere generate con un approccio simile a Holmes e Heine, utilizzando un punto temporale diverso per passare da 3D a 2D ed estendere il tempo di crescita e maturazione.
L’attuale protocollo induce il destino cerebellare nelle iPSC prive di alimentazione generando corpi embrioidi (EB) fluttuanti utilizzando insulina e FGF2 e quindi placcando gli EB su piatti rivestiti di PLO / laminina il giorno 14 per la crescita e la differenziazione 2D. Entro il giorno 35, si ottengono cellule con identità cerebellare. La capacità di ricapitolare le prime fasi dello sviluppo cerebellare, specialmente in un ambiente 2D, consente ai ricercatori di rispondere a domande specifiche che richiedono esperimenti con una struttura monostrato. Questo protocollo è anche suscettibile di ulteriori modifiche come superfici micromodellate, saggi di escrescenza assonale e ordinamento cellulare per arricchire le popolazioni cellulari desiderate.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di modellare lo sviluppo cerebellare umano in vitro è importante per la modellazione della malattia e per promuovere la comprensione del normale sviluppo del cervello. Protocolli meno complicati ed economici creano maggiori opportunità per la generazione di dati replicabili e un’ampia implementazione in più laboratori scientifici. Un protocollo di differenziazione cerebellare è descritto qui utilizzando un metodo modificato di generazione di EB che non richiede enzimi o agenti di dissociazione, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jenny Gringer Richards per il suo accurato lavoro nella convalida dei nostri soggetti di controllo, da cui abbiamo generato le iPSC di controllo. Questo lavoro è stato supportato da NIH T32 MH019113 (a D.A.M. e K.A.K.), dal Nellie Ball Trust (da T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (da V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.), e dal Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). Le figure sono state create con BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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