ヒト小脳発生 のin vitro での2次元構造モデリング
Summary
本プロトコールは、小脳発生の初期段階を調査するための人工多能性幹細胞からの小脳細胞の2D単層の生成を説明する。
Abstract
小脳の正確でタイムリーな発達は、正確な運動協調とバランスだけでなく、認知にとっても重要です。さらに、小脳発達の混乱は、自閉症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、統合失調症など、多くの神経発達障害に関与しています。ヒトの小脳発達の調査は、これまで死後研究やニューロイメージングによってのみ可能でしたが、これらの方法は、多くの神経発達障害が発生する初期発生中に 生体内で 起こる分子および細胞の変化を理解するのに十分ではありません。体細胞からヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)を生成する技術の出現と、iPS細胞をニューロンにさらに再分化する能力は、初期の脳発達の in vitro モデリングへの道を開きました。本研究は、2次元(2D)単層構造を必要とするアプリケーションのための小脳細胞を生成するための簡単なステップを提供します。発生初期を表す小脳細胞は、ヒトiPS細胞から3次元(3D)培養で作製し、FGF2とインスリンで処理して小脳運命の仕様を促進し、最後にポリ-1-オルニチン(PLO)/ラミニンコート基質上で単層として最終分化させるというステップ を経て ヒトiPS細胞に由来します。分化35日目に、iPS細胞由来の小脳細胞培養物は、ATOH1、PTF1α、PAX6、およびKIRREL2などの小脳マーカーを発現し、このプロトコルがグルタミン酸作動性およびGABA作動性の小脳ニューロン前駆体、ならびにプルキンエ細胞前駆細胞を生成することを示唆しています。さらに、分化した細胞は明確な神経形態を示し、TUBB3などの神経同一性の免疫蛍光マーカーに対して陽性である。これらの細胞は、セマフォリン-4C、キキシン-B2、ニューロピリン-1などの軸索誘導分子を発現しており、神経突起伸長やシナプス結合の分子機構を調べるためのモデルとなる可能性があります。この方法は、2D単層フォーマットを必要とする遺伝子発現、生理学的および形態学的研究を含むダウンストリームアプリケーションに役立つヒト小脳ニューロンを生成します。
Introduction
ヒトの小脳の発達とこのプロセスの重要な時間枠を理解することは、神経発達障害の考えられる原因を解読するだけでなく、治療介入の新しい標的を特定するためにも重要です。ヒト小脳発生をin vitroでモデル化することは困難でしたが、時間の経過とともに、ヒト胚性幹細胞(hESC)または小脳系統の運命を持つiPS細胞を区別する多くのプロトコルが出現しました1,2,3,4,5,6,7,8 .さらに、再現性のある結果を生成し、比較的単純で(エラーを減らすため)、金銭的コストに重くないプロトコルを開発することが重要です。
小脳分化のための最初のプロトコルは、播種胚様体(EB)からの2D培養から生成され、WNT、BMP、およびFGFを含むin vivo発生と同様のさまざまな成長因子で小脳運命を誘導しました1,9。より最近発表されたプロトコールは、主にFGF2およびインスリンを用いた3Dオルガノイド培養において分化を誘導し、続いて菱形唇様構造に対してFGF19およびSDF1が続き3、4、またはFGF2、FGF4、およびFGF8の組み合わせを使用した5。両方の小脳オルガノイド誘導法は、両方のプロトコルが同じ時点で同様の小脳マーカー発現を報告したため、同様の3D小脳オルガノイドをもたらしました。ホームズとハイネは、3Dプロトコル5を拡張して、3D凝集体として開始されるhESCとiPS細胞から2D小脳細胞を生成できることを示しました。さらに、Silvaら7は、成熟小脳ニューロンを2Dで表す細胞が、3Dから2Dに切り替え、成長と成熟の時間を延長するための異なる時点を使用して、ホームズとハイネと同様のアプローチで生成できることを示しました。
現在のプロトコルは、インスリンとFGF2を使用して自由に浮遊する胚様体(EB)を生成し、14日目にPLO /ラミニンコーティングされた皿にEBをプレーティングして2D成長と分化を行うことにより、フィーダーフリーiPS細胞に小脳運命を誘導します。35日目までに、小脳同一性を有する細胞が得られる。特に2D環境で小脳発達の初期段階を再現する能力により、研究者は単層構造の実験を必要とする特定の質問に答えることができます。このプロトコルは、マイクロパターン化された表面、軸索伸長アッセイ、および所望の細胞集団を濃縮するための細胞選別などのさらなる改変にも適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト小脳の発達 をin vitroで モデル化する能力は、疾患モデリングだけでなく、正常な脳の発達の理解を深めるためにも重要です。複雑で費用効果の低いプロトコルは、複製可能なデータ生成と複数の科学ラボにわたる広範な実装の機会を増やします。小脳分化プロトコルは、Mugurumaらによって報告された成長因子を使用して、酵素または解離剤を必要としないEBを生成する修正方法を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jenny Gringer Richards氏の、コントロールiPS細胞の生成元となった被験者の検証に徹底的に取り組んでくださったことに感謝します。この作業は、NIH T32 MH019113(D.A.M.およびK.A.K.)、NELLIE BALL Trust(T.H.W.およびA.J.W.)、NIH R01 MH111578(V.A.M.およびJ.A.W.)、NIH KL2 TR002536(A.J.W.)、およびRoy J. Carver Charitable Trust(V.A.M.、J.A.W.、A.J.W.)の支援を受けた。フィギュアは BioRender.com で作成されました。
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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