Summary

2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

본 프로토콜은 소뇌 발달의 초기 단계를 조사하기 위해 유도 만능 줄기 세포로부터 소뇌 세포의 2D 단층 생성을 설명합니다.

Abstract

소뇌의 정확하고시기 적절한 발달은 정확한 운동 조정과 균형뿐만 아니라인지에도 중요합니다. 또한 소뇌 발달의 혼란은 자폐증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD) 및 정신 분열증을 포함한 많은 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 인간의 소뇌 발달에 대한 조사는 이전에 사후 연구 또는 신경 영상을 통해서만 가능했지만 이러한 방법은 많은 신경 발달 장애가 발생하는 초기 발달 동안 생체 내에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하기에 충분하지 않습니다. 체세포에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성하는 기술의 출현과 iPSC를 뉴런으로 재 분화시키는 능력은 초기 뇌 발달의 시험관 내 모델링을위한 길을 열었습니다. 본 연구는 2차원(2D) 단층 구조가 필요한 응용 분야를 위해 소뇌 세포를 생성하기 위한 단순화된 단계를 제공합니다. 초기 발달 단계를 나타내는 소뇌 세포는 다음 단계를 통해 인간 iPSC에서 파생됩니다 : 먼저 배아체를 3 차원 (3D) 배양으로 만든 다음 FGF2 및 인슐린으로 처리하여 소뇌 운명 사양을 촉진하고 마지막으로 폴리 -l- 오르니 틴 (PLO) / 라미닌 코팅 기판에서 단층으로 말단으로 분화됩니다. 분화 35일째에 iPSC 유래 소뇌 세포 배양은 ATOH1, PTF1α, PAX6 및 KIRREL2를 포함한 소뇌 마커를 발현하며, 이는 이 프로토콜이 글루타메이트성 및 GABAergic 소뇌 뉴런 전구체와 푸르킨제 세포 전구체를 생성함을 시사합니다. 또한, 분화 된 세포는 뚜렷한 뉴런 형태를 나타내며 TUBB3와 같은 뉴런 정체성의 면역 형광 마커에 양성입니다. 이 세포는 세마포린 -4C, 플렉신 -B2 및 뉴로 필린 -1을 포함한 축삭 유도 분자를 발현하며 신경 돌기 성장 및 시냅스 연결성의 분자 메커니즘을 조사하기위한 모델이 될 수 있습니다. 이 방법은 2D 단층 형식이 필요한 유전자 발현, 생리학 및 형태학적 연구를 포함한 다운스트림 응용 분야에 유용한 인간 소뇌 뉴런을 생성합니다.

Introduction

인간의 소뇌 발달과이 과정의 중요한 시간 창을 이해하는 것은 신경 발달 장애의 가능한 원인을 해독 할뿐만 아니라 치료 적 개입을위한 새로운 표적을 식별하는 데에도 중요합니다. 시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 것은 어려운 일이었지만 시간이 지남에 따라 소뇌 혈통 운명을 가진 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 iPSC를 분화하는 많은 프로토콜이 등장했습니다.1,2,3,4,5,6,7,8 . 또한 재현 가능한 결과를 생성하고 비교적 간단하며(오류를 줄이기 위해) 금전적 비용이 많이 들지 않는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.

소뇌 분화를 위한 첫 번째 프로토콜은 도금된 배아체(EB)의 2D 배양에서 생성되어 WNT, BMP 및 FGF 1,9를 포함하여 생체 내 발달과 유사한 다양한 성장 인자로 소뇌 운명을 유도했습니다. 보다 최근에 발표된 프로토콜은 주로 FGF2 및 인슐린을 사용한 3D 오가노이드 배양에서 분화를 유도하고, 이어서 마름모꼴 립형 구조3,4에 대해 FGF19 및 SDF1을 유도하거나, FGF2, FGF4 및 FGF85의 조합을사용했습니다. 두 소뇌 오가노이드 유도 방법 모두 동일한 시점에서 유사한 소뇌 마커 발현을 보고했기 때문에 유사한 3D 소뇌 오가노이드를 생성했습니다. Holmes와 Heine은 3D 프로토콜5를 확장하여 2D 소뇌 세포가 3D 응집체로 시작하는 hESC 및 iPSC에서 생성될 수 있음을 보여주었습니다. 또한 Silva et al.7은 3D에서 2D로 전환하고 성장 및 성숙 시간을 연장하는 다른 시점을 사용하여 Holmes와 Heine과 유사한 접근 방식으로 2D에서 성숙한 소뇌 뉴런을 나타내는 세포를 생성 할 수 있음을 입증했습니다.

현재 프로토콜은 인슐린과 FGF2를 사용하여 자유 부동 배아체(EB)를 생성한 다음 2D 성장 및 분화를 위해 14일째에 PLO/라미닌 코팅 접시에 EB를 플레이팅하여 피더가 없는 iPSC에서 소뇌 운명을 유도합니다. 35 일째에 소뇌 정체성을 가진 세포가 얻어진다. 특히 2D 환경에서 소뇌 발달의 초기 단계를 요약하는 기능을 통해 연구원은 단층 구조 실험이 필요한 특정 질문에 답할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 원하는 세포 집단을 풍부하게하기 위해 마이크로 패턴 표면, 축삭 성장 분석 및 세포 분류와 같은 추가 수정이 가능합니다.

Protocol

인간 피험자 연구는 아이오와 대학교 기관 검토위원회 승인 번호 201805995 및 아이오와 대학교 인간 다 능성 줄기 세포위원회 승인 번호 2017-02에 따라 승인되었습니다. 피부 생검은 서면 사전 동의를 얻은 후 피험자로부터 얻었습니다. 섬유아세포를 37°C 및 5%CO2에서 15% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% MEM-비필수 아미노산 용액으로 DMEM에서 배양하였다. 섬유아세포는 전기천공을 위해 뉴클레오펙터를 …

Representative Results

3D에서 2D로의 소뇌 분화 개요소뇌 세포는 iPSC에서 시작하여 생성됩니다. 그림 1A 는 전체 워크플로와 차별화를 위한 주요 구성 요소의 추가를 보여줍니다. 0일째에 EB는 SB431542 및 Y-27632가 포함된 CDM의 당겨진 유리 피펫을 사용하여 iPSC 콜로니(그림 1B)를 부드럽게 들어 올리고 초저 부착 플레이트에 배치하여 만듭니다. FGF2는 2일째에 추가?…

Discussion

시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 능력은 질병 모델링뿐만 아니라 정상적인 뇌 발달에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 덜 복잡하고 비용 효율적인 프로토콜은 복제 가능한 데이터 생성 및 여러 과학 실험실에서 광범위한 구현을 위한 더 많은 기회를 만듭니다. 소뇌 분화 프로토콜은 Muguruma et al.에 의해보고 된 성장 인자를 사용하여 효소 또는 해리 제를 필요로하지 않는 EB를 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 Jenny Gringer Richards가 통제 대상을 검증하는 데 철저한 노력을 기울인 것에 대해 감사 드리며, 그로부터 통제 iPSC를 생성했습니다. 이 작업은 NIH T32 MH019113 (D.A.M. 및 K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. 및 AJW), NIH R01 MH111578 (V.A.M. 및 J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.), 및 Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. 및 AJW). 수치는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum – Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90×250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Biologie du développement. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Play Video

Citer Cet Article
Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

View Video