Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Infraroodthermografie voor de detectie van veranderingen in de activiteit van bruin vetweefsel

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64463
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 2,3
1MKP Ltd., 2Croatian Institute for Brain Research, University of Zagreb, School of Medicine, 3Department of Physiology, University of Zagreb, School of Medicine

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het meten van bruine vetweefselactiviteit na een maaltijd bij mensen en proefdieren.

Abstract

Het meten van bruin vetweefsel (BAT) activiteit door positron emissie tomografie computertomografie (PET-CT) via de accumulatie van 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) na een maaltijd of bij zwaarlijvige of diabetische patiënten faalt als de methode van keuze. De belangrijkste reden is dat 18F-FDG concurreert met de postprandiale hoge glucoseplasmaconcentratie voor dezelfde glucosetransporter op het membraan van BAT-cellen. Bovendien gebruikt BAT vetzuren ook als energiebron, wat niet zichtbaar is met PET-CT en kan worden veranderd samen met de glucoseconcentratie bij zwaarlijvige en diabetespatiënten. Om het fysiologische belang van BBT bij dieren en mensen te schatten, wordt daarom een nieuwe infraroodthermografiemethode toegepast die in recente publicaties wordt gebruikt.

Na 's nachts vasten werd de BAT-activiteit gemeten door infraroodthermografie voor en na een maaltijd bij menselijke vrijwilligers en vrouwelijke wild-type muizen. De camerasoftware berekent de temperatuur van het object op basis van de afstand tot het object, de emissiviteit van de huid, de gereflecteerde kamertemperatuur, de luchttemperatuur en de relatieve vochtigheid. Bij muizen was het geschoren gebied boven de BBT een interessant gebied waarvoor gemiddelde en maximale temperaturen werden gemeten. De fase van de oestruscyclus bij vrouwelijke muizen werd bepaald na een experiment met vaginale uitstrijkjes gekleurd met cresylviolet (0,1%) vlekoplossing. Bij gezonde vrijwilligers werden twee huidgebieden van de nek geselecteerd: het supraclaviculaire gebied (boven het sleutelbeen, waar BAT-cellen aanwezig zijn) en het interclaviculaire gebied (tussen de sleutelbeenderen, waar geen BAT-weefsel is gedetecteerd). De BBT-activiteit wordt bepaald door de aftrekking van deze twee waarden. Ook konden de gemiddelde en maximale temperaturen van huidgebieden worden bepaald bij dieren en menselijke deelnemers.

Veranderingen in BBT-activiteit na een maaltijd gemeten met infraroodthermografie, een niet-invasieve en meer gevoelige methode, bleken afhankelijk te zijn van geslacht, leeftijd en fase van de oestruscyclus bij proefdieren. Als onderdeel van door voeding geïnduceerde thermogenese is ook bewezen dat BAT-activering bij mensen afhankelijk is van geslacht, leeftijd en body mass index. Het verder bepalen van de pathofysiologische veranderingen in BAT-activiteit na een maaltijd zal van groot belang zijn voor deelnemers met hoge glucoseplasmaconcentraties (obesitas en diabetes mellitus type 2), evenals bij verschillende proefdieren (knock-out muizen). Deze methode is ook een variabel hulpmiddel voor het bepalen van mogelijke activerende geneesmiddelen die de BAT-activiteit kunnen verjongen.

Introduction

Bruin vetweefsel (BAT) slaat, in tegenstelling tot wit vetweefsel (WAT), geen energie op, maar besteedt er juist energie aan. Bij sympathische stimulatie maakt BAT gebruik van vetzuren en glucose en produceert warmte door de activering van ontkoppelend eiwit 1 (UCP1). De functie van UCP1 is om een H + -gradiënt tussen twee mitochondriale membranen te gebruiken om warmte te produceren in plaats van ATP. De functie van BBT is het verhogen van de warmteproductie onder koude omstandigheden, wat leidt tot een toename van het energieverbruik1. Na blootstelling aan koude remmen sensorische inputs van de huid warmgevoelige neuronen in de mediane preoptische (MnPO) kern van het hypothalamische preoptische gebied (POA), wat het remmende effect van POA-neuronen op de rostrale raphe pallidus (rRPa) vermindert. De activering van rRPa-neuronen verhoogt de sympathische activiteit, gevolgd door een toename van de BBT-activiteit 2,3. Door koude geïnduceerde BAT-activering verbetert de insulinegevoeligheid bij mensen4, en deze activiteit is afgenomen bij mensen met een verhoogde body mass index (BMI) en een leeftijdvan 1,5,6,7.

Afgezien van zijn rol in koude-geïnduceerde thermogenese, neemt de glucoseopname in de BAT na een maaltijd toe in de magere mannelijke populatie, wat bijdraagt aan door voeding geïnduceerde thermogenese (DIT), die hoger is bij BAT-positieve mannelijke proefpersonen 8,9. De state-of-the-art techniek die wordt gebruikt voor het meten van BBT-activiteit is positronemissietomografie computertomografie, bekend als PET-CT. Deze methode bepaalt de BBT-activiteit door de accumulatie van de radiotracer fluorodeoxyglucose (18F-FDG) te meten. PET-CT faalt echter als de voorkeursmethode voor het detecteren van de activering van BBT na een maaltijd. Een van de redenen is dat, na een maaltijd, 18F-FDG concurreert met postprandiale hyperglycemie voor dezelfde glucosetransporter, waardoor het ongeschikt is voor het bepalen van BAT-activering na een maaltijd, vooral bij het vergelijken van BAT-activiteit bij gezonde en diabetische deelnemers met mogelijke verschillen in bloedglucoseconcentraties. Bovendien gebruikt de BBT vetzuren als energiebron voor warmteproductie die niet zichtbaar is met PET-CT. 18 F-FDG accumulatie in BAT na een maaltijd is nauwelijks zichtbaar10 en wordt daarom in de meeste gevallen geïnterpreteerd als een negatief resultaat. Het is niet verwonderlijk dat onlangs werd gesuggereerd dat de activering van BBT meer uitgesproken is in de menselijke populatie dan we eerder hadden gedacht; daarom is een nieuwe aanpak nodig om BBT-activiteit en de betrokkenheid ervan bij metabole stoornissen te detecteren7. Een poging om dit probleem op te lossen is het meten van het volume van BAT met magnetische resonantie beeldvorming (MRI) bij prediabetische patiënten en patiënten met diabetes mellitus type 2 (T2DM) met insulineresistentie11. Het BBT-volume gemeten met MRI is echter geen voldoende indicator voor het schatten van de dagelijkse functie en het gebruik van glucose en vetzuren door BAT. Om echte verschillen in BAT-activiteit bij gezonde versus T2DM-patiënten te schatten, is daarom een nieuwe aanpak nodig die een mogelijkheid biedt om het pathologische mechanisme van BAT-storing bij T2DM-patiënten te achterhalen.

Om de activering van BBT te bepalen, hebben we metingen van BBT-warmteproductie voor en na een maaltijd uitgevoerd met behulp van infrarood (IR) thermografie (figuur 1)12,13. Het vaststellen van IR-thermografie als een voorkeursmethode voor het meten van BAT-activiteit na een maaltijd bij gezonde en zwaarlijvige personen of patiënten met diabetes mellitus zal een enorme impact hebben op het veld. Tot op de dag van vandaag wordt IR-thermografie gebruikt voor de bepaling van koude-geïnduceerde activering van BBT13,14,15. In de recente menselijke geschiedenis is koude-geïnduceerde BBT-activiteit niet erg uitgesproken meer (als gevolg van de juiste verwarming van habitats, goede kleding), terwijl BBT-activering na een maaltijd elke dag plaatsvindt. Bovendien is de fysiologische regulatie van deze twee BBT-functies via de hypothalamus totaal verschillend. Na een maaltijd leidt de activering van proopiomelanocortine (POMC)-tot expressie brengende neuronen in de hypothalamusboogkern (Arc) tot een toename van de sympathische zenuwactiviteit via rRPa16. Koude-geïnduceerde activering van BBT gemeten door IR-thermografie of PET-CT is onjuist wanneer het wordt gebruikt als een maat voor dagelijkse BBT-activiteit. Verhoogde BAT-activiteit na een maaltijd wordt gevolgd door glucosegebruik, wat uiteindelijk belangrijk is voor het handhaven van glucosehomeostase, insulinegevoeligheid en de dagelijkse regulatie van glucoseconcentratie. Postprandiale BBT-activering leidt tot een toename van het postprandiale glucoseverbruik, gevolgd door een toename van de warmteproductie en lichaamstemperatuur (DIT). Dit bleek geslachts-, leeftijds- en BMI-afhankelijkte zijn 12. Vergelijkbare geslachtsverschillen in BAT-activering na een maaltijd worden waargenomen bij mannelijke en vrouwelijke laboratoriummuizen17. Deze bevindingen komen overeen met recent ontdekte geslachtsverschillen in de regulatie van BAT door Burke et al., die aantoonden dat de hypothalamische regulatie van BAT browning via een subpopulatie van POMC-neuronen verschilt bij mannelijke en vrouwelijke muizen18. De postprandiale activering van BAT is kleiner bij vrouwen, oudere populaties en zwaarlijvige mensen. Het ontbreken van BAT-activering na een maaltijd (verminderd glucosegebruik) kan leiden tot een hogere prevalentie van verminderde glucosetolerantie bij vrouwen 19,20,21,22. Helaas werden de meeste onderzoeken naar BAT-activering alleen bij mannen uitgevoerd. Door BAT na een maaltijd te activeren, neemt de glucoseopname toe in de magere mannelijke populatie. Het is niet verwonderlijk dat, na BAT-activering, DIT hoger is bij BAT-positieve mannelijke proefpersonen 8,9. Bovendien verbetert BAT-transplantatie bij mannelijke muizen de glucosetolerantie, verhoogt het de insulinegevoeligheid en vermindert het lichaamsgewicht en de vetmassa23.

PET-CT faalt als voorkeursmethode voor het meten van BBT-activiteit, vooral na een maaltijd. Daarom werd een niet-invasieve en meer gevoelige methode ontwikkeld. IR-thermografie maakt het mogelijk om de BBT-activiteit te schatten bij verschillende proefdieren (knock-out muizen) en bij menselijke deelnemers, ongeacht geslacht, leeftijd of de effecten van verschillende pathologische aandoeningen op de BBT-activiteit. Een bijkomend voordeel van deze methode is de eenvoud voor deelnemers en proefdieren, waardoor we de potentiële voordelen van BAT-boostertherapie kunnen inschatten. De recente studies met behulp van IR-thermografie voor het bepalen van het fysiologische gedrag van BAT na blootstelling aan koude of een maaltijd worden beschreven in de recente publicatie van Brasil et al.24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures voor proefdieren zijn goedgekeurd door het Nationaal Ethisch Comité en het ministerie van Landbouw (EP 185/2018). De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische codex van de Kroatische vereniging voor proefdierwetenschap en de ARRIVE-richtlijnen. Alle procedures uitgevoerd in studies met menselijke deelnemers waren in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Universiteit van Zagreb, School of Medicine (UP / I-322-01/18-01/56). In deze studie presenteren we de resultaten van drie vrouwelijke deelnemers (BMI: 29 kg/m 2 ± 5 kg/m2). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle menselijke vrijwilligers voor hun deelname aan het onderzoek en voor het presenteren van de gegevens.

1. Het meten van de activering van bruin vetweefsel na een maaltijd bij de mens

OPMERKING: Voer de experimenten uit tijdens de zomer wanneer de dagelijkse temperatuur niet lager is dan 22 °C om de basale BBT-activiteit zo laag mogelijk te houden.

  1. Kies zorgvuldig de controle gezonde deelnemers (als de BBT-activiteit moet worden geschat onder pathologische omstandigheden), aangezien de BBT-activiteit geslachts-, leeftijds-, BMI- en zelfs de fase van de oestruscyclus afhankelijk is.
    1. Om de fase van de menstruatiecyclus van vrouwelijke deelnemers te schatten, stelt u hen vragen over hoe lang hun gemiddelde menstruatiecyclus is en de datum van de eerste dag van hun laatste menstruatie. Vergeet niet om de datum van de experimenten te markeren.
      OPMERKING: Een goede selectie van overeenkomende controlepersonen is het moeilijkste deel van klinische onderzoeken, omdat gezonde controles en deelnemers met pathologische aandoeningen zo veel mogelijk op elkaar moeten lijken en alleen verschillen in de onderzochte ziekte.
  2. Vraag de deelnemers om goed te rusten, niet te ontbijten (vasten - geen inname van calorieën), om zich in de ochtenduren te verzamelen voor de experimenten en om minstens 30 minuten te rusten om mogelijke BAT-activering tijdens spieractiviteit via sympathische activering te voorkomen.
  3. Vraag de deelnemers om hun bovenste kleding 15 minuten voor de metingen uit te trekken om de mogelijke effecten van het verwarmen van het huidoppervlak (thermische effecten van kleding) te voorkomen tijdens het bepalen van de baseline BBT-activiteit. Voer metingen uit bij de juiste kamertemperatuur (22-27 °C).
  4. Voer infraroodmetingen uit.
    1. Terwijl de deelnemers rusten, monteer de thermische camera (detectortype: ongekoelde microbolometer; detector pitch: 17 μm; camera spectraal bereik: 7,5-14,0 μm; thermische gevoeligheid: 20 mK bij 30 °C; lenzen: 36 mm; resolutie: 1024 pixels x 768 pixels; momentaan gezichtsveld [IFOV]: 0,47 mRad) op het statief en plaats het op 1 m afstand van de plek waar de deelnemer zal zitten.
      OPMERKING: Als de metingen worden uitgevoerd bij kouder weer (buitenluchttemperaturen onder 15 °C bij 50% luchtvochtigheid), zet u de camera op kamertemperatuur en zet u deze ten minste 1 uur aan voordat u de metingen uitvoert. Koude instrumenten kunnen verschillende resultaten geven na het opwarmen tot kamertemperatuur als gevolg van autocalibratie.
    2. Sluit de thermische camera aan op een computer en software volgens de instructies van de fabrikant. Neem aluminiumfolie (verfrommeld en vervolgens uitgerekte aluminiumfolie) op bij een brandpuntsafstand van 1 m om de gereflecteerde temperatuur van de kamer te bepalen, gepresenteerd als gemeten temperatuur. Voer in de camerasoftware de afstand van 0 m en de emissiviteit van 1 in.
      OPMERKING: De gereflecteerde schijnbare temperatuur is een parameter die wordt verkregen wanneer de emissiviteit van de camera is ingesteld op 1,0 en de afstand tot 0 m en de metingen worden uitgevoerd op verfrommelde en vervolgens uitgerekte aluminiumfolie. Gereflecteerde schijnbare temperatuur vertegenwoordigt een benadering van de totale invallende infraroodstraling op de detector uit de omgeving.
    3. Bepaal vlak voor het begin van de metingen de kamertemperatuur en luchtvochtigheid (nodig voor latere analyse). In plaats van één warmtebeeld te maken, neemt u een film op. Kies later uit de film het best mogelijke beeldframe voor analyse om de kans op verlies van waardevolle gegevens te verminderen.
    4. Voordat u de opname start, stelt u de volgende parameters in: de duur van de video-opname op 10-15 s (of een andere gewenste waarde), de framesnelheid op 5 fps (frames per seconde) of een andere waarde (in onze handen is 5 fps het maximaal nodige) en een locatie op de schijf waar de film wordt opgeslagen, zoals hieronder beschreven.
      1. Kies in de software boven het hoofdcameravenster het derde pictogram aan de linkerkant. Kies in het venstermenu de optie Recordinstellingen bewerken, waarna een nieuw venster wordt geopend.
      2. Selecteer in de opnamemodus Opnemen op schijf en stel daaronder de record voor deze duur in op het gewenste tijdstip. Beperk in de opnameopties van hetzelfde venster de opnamesnelheid tot 5 (Hz) en kies de locatie waar de opnamen worden opgeslagen.
      3. Als u de framesnelheid wilt instellen, sluit u het bestaande venster, opent u Bewerken in het hoofdmenu en selecteert u Voorkeuren. Voer in het rechterdeel van het geopende venster 5 in bij Doelframesnelheid. Selecteer in hetzelfde venster hieronder Sneltoets / Remote Start kan de opname stoppen en selecteer in het vervolgkeuzemenu In de start / stop-modus.
        OPMERKING: Probeer de kortst mogelijke films te maken met de laagst mogelijke framesnelheid, omdat dit geheugenverslindend is. Bij deze instellingen heeft één record ongeveer 100 Mb.
  5. Plaats de deelnemer zo dat het supraclaviculaire gebied van de nek, boven het sleutelbeen waar BAT zich bevindt (figuur 1), zich op een brandpuntsafstand van 1 m bevindt en neem een korte film (10-15 s) op met een framesnelheid van 5 fps door op de F5-toets te drukken. De opname stopt op het aangegeven tijdstip.
  6. Zorg ervoor dat op het moment van de metingen alleen de deelnemer en de persoon die de metingen uitvoert in de ruimte aanwezig zijn. Vermijd luchtbeweging of tocht (bijvoorbeeld van airconditioning). Zorg ervoor dat de deelnemers uit de buurt zijn van koude tocht, zonlicht (direct of indirect) of een warmtebron zoals gloeilampen.
  7. Meet indien geschikt de bloedglucoseconcentraties in capillair bloed vanaf de vingertop met een standaard glucometer en de lichaamstemperatuur met behulp van een okselthermometer.
  8. Zorg ervoor dat alle deelnemers dezelfde maaltijd eten. Let op de voedselbeperkingen en -vereisten van de geteste proefpersonen (bijvoorbeeld de maaltijd voor diabetespatiënten). Alle deelnemers, inclusief controle (gezonde) mensen en deelnemers met stofwisselingsstoornissen, moeten dezelfde maaltijd eten.
    OPMERKING: Voor meer informatie over maaltijden die diabetespatiënten kunnen consumeren, neemt u contact op met een lokale endocrinoloog of bespreekt u het met de deelnemers die lijden aan diabetes mellitus.
  9. Maak op het gewenste tijdstip na een maaltijd de nieuwe opname door op F5 te drukken met dezelfde instellingswaarden. Herhaal het ingestelde protocol voor opnamen niet. Herhaal de metingen op 30 min, 1 h, 2 h en 3 h na een maaltijd12. Voor uw specifieke onderzoeksopzet kan de tijd na een maaltijd korter of langer zijn, maar we raden ten minste de eerste drie tijdspunten aan.
    OPMERKING: De beperking van het aantal deelnemers is vier tot zes, ook al worden de metingen snel gedaan. Bij een hoger aantal deelnemers zal de vertragingstijd voor sommigen te lang zijn.

2. Het meten van de activering van bruin vetweefsel na een maaltijd bij proefdieren

OPMERKING: Aangezien de dieren worden gehuisvest in een dierenfaciliteit met gereguleerde kamertemperatuur en een dag/nachtcyclus van 12 uur/12 uur, kunnen de experimenten in elk seizoen worden uitgevoerd. De kamertemperatuur tijdens experimenten moet tussen 22 °C en 27 °C liggen. In deze studie werden zes vrouwelijke dieren in diestrus en zes mannelijke wild-type (WT) C57Bl/6NCrl dieren onderzocht.

  1. Verdoof de dieren volgens de ethische richtlijnen van de instelling. In deze studie werd anesthesie uitgevoerd met behulp van i.p. injecties van ketamine / xylazine (respectievelijk 80-100 mg / kg en 6-8 mg / kg). Breng ooggel aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de anesthesie te voorkomen. Scheer de interscapulaire gebieden van de proefdieren een dag voor de experimenten (het gebied van de huid tussen de schouderbladen) met behulp van een trimmer voor kleine dieren.
  2. De dag voor de experimenten wordt ook de fase van de oestruscyclus bij vrouwelijke dieren bepaald.
    OPMERKING: De fase van de oestruscyclus wordt bepaald door vaginale uitstrijkjes.
    1. Doop een wattenstaafje in een steriele zoutoplossing op kamertemperatuur (0,9% NaCl) en breng het in de vagina in. Schraap de vaginawand voorzichtig met het wattenstaafje, verdeel de aangehechte cellen op een glazen dia en laat het aan de lucht drogen.
    2. Zet de dieren terug in hun kooien. Kleurt de cellen met 500 μL van 0,1% cresylageviolet acetaat gedurende 1 min, waarna ze 3 keer met water worden gespoeld.
    3. Bekijk de cellen onder een lichtmicroscoop met 100x vergroting en heldere veldverlichting. Bepaal de fase van de oestruscyclus op basis van het aantal leukocyten en nucleated en cornified epitheliale cellen waargenomen in het uitstrijkje25.
  3. Verwijder het voedsel van de dieren de avond voor de experimenten ('s nachts vasten) met water ad libitum. De beste manier is om de dieren over te brengen naar nieuwe schone kooien om mogelijke voedselresten in de kooien te voorkomen.
  4. Bereid op de ochtend van de experimentele dag de thermische camera en opname-instellingen voor zoals gedaan voor het testen van de menselijke deelnemers.
  5. Verstoor of veroorzaak geen stress bij de dieren voordat u IR-metingen uitvoert. Plaats het dier voorzichtig in een schone kooi (zorgt ervoor dat er geen effecten zijn van de geur van andere dieren op het sympathische systeem van het dier). Plaats de kooi onder de thermische camera op een brandpuntsafstand van 1 m. Neem een film op door op F5 te drukken.
  6. Weeg de voedselkorrel af voordat u deze aan elk dier geeft, zodat de voedselinname kan worden berekend. Laat het dier 30 minuten in zijn kooi eten en weeg de voerkorrel na de maaltijd opnieuw. In deze studie aten vrouwelijke dieren 0,038 ± 0,004 g voedsel / lichaamsgewicht.
    OPMERKING: Als u besluit om bloedglucoseconcentraties te meten, voert u de metingen uit vóór een maaltijd, maar na IR-metingen om ervoor te zorgen dat dit niet leidt tot BAT-activering door het sympathische systeem.
  7. Herhaal IR-metingen op het gewenste tijdstip na het begin van een maaltijd (meestal 30 min, 1 uur en 2 uur na een maaltijd)17,26.
  8. Nadat alle experimenten zijn voltooid, test u opnieuw de fase van de oestruscyclus bij vrouwelijke dieren zoals hierboven beschreven (vrouwelijke dieren kunnen de gewenste fase van de oestruscyclus eerder verlaten dan verwacht).

3. Analyseren van de thermische opnames

OPMERKING: De thermische camerasoftware berekent de temperatuur van het object met behulp van vijf variabelen.

  1. Stel vóór de analyse de volgende variabelen in de software in: huidemissiviteit, e = 0,9815,27, gereflecteerde kamertemperatuur (zoals berekend op basis van de afbeelding van aluminiumfolie), luchttemperatuur, relatieve vochtigheid, afstand tot het object = 1 m. Voer de analyse uit met behulp van de software met deze waarden.
    OPMERKING: Het voorkeurskleurenpalet is regenboog omdat het meer tinten gebruikt, waardoor BAT boven het sleutelbeen gemakkelijker kan worden gedetecteerd.
  2. Voer voor elke film de vermelde variabelen in de camerasoftware aan de rechterkant van het hoofdvenster in. Selecteer het geschikte frame (afbeelding) uit de film door de afspeelkop onder aan het scherm te bewegen of op de pauzeknop te drukken.
  3. Selecteer de regio van belang (ROI) door de gewenste vorm van het gebied aan de linkerkant van het hoofdvenster te kiezen. Kies de vorm die het beste overeenkomt met het gebied van de huid boven of tussen de sleutelbeenderen.
  4. Wanneer de ROI wordt gekozen, worden de minimale, maximale en gemiddelde temperaturen van de ROI aan de rechterkant weergegeven. In de afbeelding vertegenwoordigt de rode driehoek het punt van de maximale geregistreerde temperatuur en de blauwe driehoek de minimale geregistreerde temperatuur. Herhaal deze stap voor meerdere frames om er zeker van te zijn dat de gemeten temperatuur stabiel is gedurende enkele seconden van de opname.
  5. Trek de maximale temperaturen van het huidgebied boven de BBT vóór een maaltijd af van de maximale temperaturen na een maaltijd om de toename van de postprandiale BBT-activiteit bij proefdieren te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eenvoudigste manier om de BBT-activiteit te bepalen, is door de maximale huidtemperatuur boven de BBT voor en na een maaltijd bij menselijke proefpersonen af te trekken. Een betere manier om de BBT-activiteit te berekenen, is door twee gebieden van belang te selecteren: het huidgebied boven de BBT, dat zich in het supraclaviculaire gebied bevindt, en het interclaviculaire gebied van de huid waar geen BBT-weefsel bij mensen wordt aangetroffen, aangewezen als referentiegebied (volgens PET-CT; Figuur 1). De BBT-activiteit wordt dan eenvoudig bepaald door het aftrekken van die twee temperaturen. Zoals te zien is in figuur 1, werd de BBT-activiteit bepaald als 1,8 °C. Om de activering van BBT na voeding te bepalen, werd dit herhaald op aangewezen tijdstippen na een maaltijd12. In deze studie voerden we experimenten uit met drie vrouwelijke deelnemers. Vergelijkbare resultaten werden verkregen van deelnemer 1 en deelnemer 2 met BMI's van respectievelijk 23 kg/m 2 en 34 kg/m2. Deelnemer 3 had de laagste BMI (18 kg/m2) en de hoogste toename in BAT activiteit na een maaltijd (figuur 1B, links). De maximale temperatuur op het supraclaviculaire gebied van de huid is geen goede weergave van de BBT-activiteit, omdat er zelfs 3 uur na een maaltijd geen afname van de huidtemperatuur is (figuur 1B, rechts). Vanwege verschillen in BAT-activiteit tussen de menselijke populatie, moet de analyse van de resultaten individueel worden uitgevoerd en / of de keuze van de deelnemer voor het onderzoek moet zeer zorgvuldig worden gedaan. Er is niet zo'n verschil in BBT-activiteit bij proefdieren, omdat ze nauw verwant zijn.

Het eerste voordeel van deze methode ten opzichte van het gebruik van PET-CT (18F-FDG) is dat het de BBT-activiteit meet, ongeacht de warmtebron. Om die reden is IR-thermografie veel gevoeliger en geeft het de BAT-activiteit onder verschillende fysiologische of pathofysiologische omstandigheden waarheidsgetrouwer weer. Deze methode kan worden gebruikt om de fysiologische omstandigheden te bepalen die leiden tot veranderingen in BBT-activiteit, zoals leeftijd, geslacht of fase van de oestruscyclus. Bij mensen is een bijkomend voordeel het vermogen om de pathofysiologische veranderingen in BAT-activiteit te bepalen bij metabole ziekten zoals obesitas en diabetes mellitus type 2. Een bijzonder voordeel kan worden gezien bij het vergelijken van de BBT-activiteit van mensen met een hoge bloedglucoseconcentratie met gezonde controles, omdat bij PET-CT de radioactieve glucose concurreert met dezelfde glucosetransporters als glucose in het lichaam, wat leidt tot vals negatieve resultaten of verkeerde voorstellingen van BBT-activiteit.

Een mogelijke zorg is de verschillen in de dikte van de huid, met name het onderhuidse witte vetweefsel, dat de huidtemperatuur boven BAT bij verschillende proefpersonen kan veranderen28. Dit probleem kan worden voorkomen door de BBT-activering voor en na een maaltijd te vergelijken. Gewoonlijk worden de activiteit en het daaropvolgende belang voor verschillende pathofysiologische aandoeningen bepaald door BAT-activering na blootstelling aan koude. Dit type BBT-activering is echter seizoensgebonden en bij mensen (in vergelijking met dieren in de wildernis) niet erg belangrijk. Om de effecten van BAT-activiteit op het dagelijks leven te bepalen, evenals glucosehomeostase, is BBT-activering na een maaltijd gevolgd door glucose- en vetzuurgebruik de juiste manier.

Er moet aandacht worden besteed aan de metingen die worden uitgevoerd in een warme omgeving of te snel na spieractiviteit. Spieractiviteit verhoogt de lichaamstemperatuur, wat leidt tot vasodilatatie in de huid (figuur 2). Wanneer er geen zichtbaar warmer huidgebied boven de BBT is in vergelijking met de omliggende huidgebieden, sluit u de opnamen uit van het onderzoek.

De BBT-activiteit bij proefdieren wordt bepaald door de maximale temperatuur van de BBT tussen de scapula (interscapulaire BBT, iBAT) en de gemiddelde temperatuur van de huid boven de iBAT. Het is gemakkelijker om de gemiddelde temperatuur van de huid boven de BBT bij proefdieren te meten, omdat deze meer gelokaliseerd is dan bij mensen (figuur 3). In deze studie werden de veranderingen in BBT-activiteit na een maaltijd gemeten bij vrouwelijke WT-dieren in diestrus (28,2 ± 0,5 weken oud). Zoals te zien is in figuur 3, werden statistisch significante veranderingen in BBT-activiteit 30 minuten na een maaltijd bepaald, maar alleen wanneer de maximale temperatuur werd gemeten (p < 0,05). Wanneer de BBT-activiteit werd gepresenteerd als veranderingen in gemiddelde temperaturen, was de verandering niet significant (p = 0,066). Daarom is het presenteren van de BBT-activiteit via veranderingen in de maximale temperatuur van het interscapulaire huidgebied een betere manier om de resultaten te presenteren. Deze verandering in BBT-activiteit was positief gecorreleerd met de hoeveelheid ingenomen voedsel (r = 0,65).

De belangrijkste zorgen voor beide groepen proefpersonen zijn de biologische verschillen in BBT-activering bij mannelijke en vrouwelijke en jonge en oude dieren, evenals de verschillen in BBT-activiteit tijdens de oestruscyclus17. Speciale aandacht moet worden besteed aan de hoeveelheid tijd die is verstreken vanaf de laatste maaltijd, die moeilijk in te schatten zal zijn als het bovenstaande protocol niet wordt gevolgd. Het uitvoeren van experimenten op hetzelfde tijdstip in de ochtend is niet precies genoeg17.

Een extra zorg bij het meten van BBT-activiteit is om stress bij de dieren zoveel mogelijk te vermijden. Elke verstoring zal de sympathische activiteit verhogen en dus de BBT-activiteit16. Bovendien kunnen de meeste fouten met temperatuurregistraties optreden als het interscapulaire gebied van de muizen niet goed wordt geschoren, wat kan leiden tot het meten van het verkeerde deel van de huid.

Figure 1
Figuur 1: Infraroodthermografie. (A) Er worden twee huidgebieden geselecteerd: één boven het bruine vetweefsel (BBT; supraclaviculair gebied) en de tweede boven het interclaviculaire gebied (geen BBT-weefsel aanwezig onder de huid van dit gebiedsreferentiepunt). De BBT-locatie wordt gepresenteerd als het warmste gebied boven het sleutelbeen. De schematische weergave van de BBT-locatie in de nek volgens PET-CT is weergegeven in de linker figuur. Temperaturen zijn maximale temperaturen gemeten in omcirkelde huidgebieden. De balk vertegenwoordigt 5 cm. (B) De verschillen tussen de maximale temperaturen in beide huidgebieden worden voor elke deelnemer weergegeven, waarbij de toename van de BBT-activiteit 2 uur na een maaltijd wordt weergegeven (links). De BBT-activiteit kan niet worden weergegeven door de maximale temperatuur van de huid boven de BBT (rechts). De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. * p < 0,05 ten opzichte van de startwaarde (gepaarde ANOVA). Afkorting: SC = suprascapulair. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De omstandigheden waarin de BBT-activiteit niet kan worden gemeten. De figuur geeft de omstandigheden weer waarin het niet mogelijk is om de BBT-activiteit te bepalen als gevolg van verhoogde vasodilatatie van de bloedvaten van de huid. De balk vertegenwoordigt 5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bruin vetweefsel bij laboratoriummuizen. (A,B) Interscapulair bruin vetweefsel (BAT) wordt geactiveerd na blootstelling aan koude en pas dan weergegeven als 18F-FDG accumulatie door PET-CT. De activiteit van BAT kon worden gezien met een thermische camera zonder blootstelling aan kou. C) De locatie van de BBT in de thermische scan komt overeen met de BBT die door een pijl in het PET-CT-beeld wordt weergegeven. Het geschoren gebied is groter dan de BBT om alle temperatuurveranderingen te kunnen zien (de locatie van Tmax kon niet perfect worden voorspeld en in sommige onderzoeken kan de gemiddelde temperatuur worden gemeten). De staaf vertegenwoordigt 1 cm. (D) De gemeten maximale en gemiddelde temperaturen van de huid boven BAT voor zes vrouwelijke muizen in diestrus worden weergegeven. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. * p < 0,05 ten opzichte van de startwaarde (gepaarde ANOVA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Recente studies presenteren groeiend bewijs met betrekking tot de fysiologische regulatie en het belang van BAT-activiteit bij volwassen mensen en dieren bij de ontwikkeling van obesitas en diabetes mellitus. Bovendien wordt mogelijke BBT-activering door exogene activatoren een doelwit voor farmaceutische bedrijven. Om de fysiologische regulatie en het pathofysiologische belang van BAT bij zeer belastende ziekten te kunnen inschatten en een potentiële therapeutische benadering te kunnen ontdekken, wordt infraroodthermografie de voorkeursmethode. Hoewel de IR-technologie in opkomst is als een nieuwe methode bij uitstek voor het meten van BBT-activiteit 12,13,14,15,17, moet speciale aandacht worden besteed aan de toegepaste methode zelf, maar aan de fysiologische kenmerken van BBT-activering. Men moet speciale aandacht besteden aan geslacht, leeftijd, fase van de oestruscyclus, voedingsstatus en mogelijke stress bij menselijke deelnemers en proefdieren.

Metingen van de toename van BBT-activiteit na een maaltijd uitgevoerd op mensen en proefdieren zijn vrij gelijkaardig12,17. Kritische stappen bij het uitvoeren van deze metingen omvatten het vermijden van stress en spieractiviteit (dieren mogen niet worden gestoord voordat ze metingen uitvoeren). Voor vrouwelijke deelnemers moet rekening worden gehouden met de functionele verschillen in BAT-activiteit tijdens de oestruscyclus (menstruatiecyclus). Bovendien moet de huid kaal zijn (dieren moeten de dag voordat experimenten worden uitgevoerd worden geschoren om onnodige stress te voorkomen). Verder is het erg belangrijk om de camerasoftware goed in te stellen om de best mogelijke thermische resolutie te krijgen. Om de gegevens als warmtebeelden te presenteren, is de beste manier om een goed kleurenpalet te kiezen dat past bij het specifieke onderzoek. Als het protocol goed wordt gevolgd, is er minder kans op fouten bij het uitvoeren van IR-thermografie.

De beperking van de methode is dat het niet mogelijk is om zonder enige bezorgdheid de BBT-activiteit te vergelijken tussen mensen met verschillende hoeveelheden onderhuids vet (of zwaarlijvige dieren met dieren met een normaal lichaamsgewicht). Om dit probleem te voorkomen, moet dezelfde proefpersoon worden gebruikt als de controle door de BBT-activiteit voor en na een maaltijd te meten. De berekening van de toename van de BBT-activiteit na een maaltijd zal de verschillen in warmteverdeling van de onderhuidse BBT naar het huidoppervlak elimineren.

Het rapporteren van BBT-activiteit door veranderingen tussen de maximale huidtemperaturen van beide huidgebieden is naar onze mening een betere manier, omdat het de verschillen in BBT-grootte en / of aangewezen huidgebied elimineert in de resultaten verkregen door gemiddelde temperatuurmetingen29.

Zoals eerder vermeld, is PET-CT met behulp van radioactieve glucose (18F-FDG) de voorkeursmethode voor het meten van BBT-activiteit. Deze methode is in de loop van de tijd niet gevoelig genoeg gebleken, het gebruik van radioactief materiaal is zorgwekkend en het is erg duur. PET-CT is nutteloos bij het bepalen van BBT-activering na een maaltijd. 18 F-FDG accumulatie in BAT na een maaltijd is nauwelijks zichtbaar10 en wordt beschouwd als een negatief resultaat. Onlangs werd gesuggereerd dat BBT-activering meer uitgesproken is in de menselijke populatie en daarom steeds belangrijker wordt bij de ontwikkeling en verspreiding van metabole ziekten7. Een poging om dit probleem op te lossen is het meten van het BAT-volume door MRI bij prediabetica en patiënten met T2DM met insulineresistentie11. De hoeveelheid BBT geeft echter geen informatie over de activiteit van BBT en het gebruik van glucose en vetzuren, wat belangrijk is bij diabetespatiënten.

Het vaststellen van IR-thermografie als een voorkeursmethode voor het meten van BBT-activiteit, vooral bij menselijke proefpersonen met een hoge bloedglucoseconcentratie, zal een enorme impact hebben op het veld. IR-thermografie wordt gebruikt voor de bepaling van koude-geïnduceerde activering van BBT 13,14,15 en, recentelijk, BBT-activering na een maaltijd bij gezonde vrijwilligers 12 en proefdieren 17. De postprandiale BBT-activering is kleiner bij vrouwtjes en oudere proefpersonen, ongeacht de soort. Helaas is het grootste deel van het onderzoek naar BBT-activering en metabole studies in totaal alleen uitgevoerd op mannelijke proefpersonen (mannelijke proefdieren of mannen). Het probleem met deze benadering is dat het effect van de fase van de oestruscyclus op BBT-activiteit30 wordt genegeerd.

Ten slotte zal IR-thermografie de mogelijkheid bieden om het fysiologische en pathofysiologische belang van BAT in verschillende menselijke populaties te onderzoeken, vooral bij pre- en postmenopauzale vrouwen, waarvoor studies ontbreken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door de Kroatische Science Foundation onderzoeksbeurs (IP-2018-01- 7416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% cresyl violet acetate  Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity Kesterl Kestrel 4200 Certificat of conformity
External data storage Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides Commonly used
Small cotton tip swab  Urethral swabs
Software for analysis FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR Tools
Software for meassurements FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA ResearchIR software FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR T-1020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  2. Morrison, S. F., Nakamura, K. Central neural pathways for thermoregulation. Frontiers in Bioscience. 16 (1), 74-104 (2011).
  3. Contreras, C., et al. The brain and brown fat. Annals of Medicine. 47 (2), 150-168 (2015).
  4. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  5. Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 96 (1), 192-199 (2011).
  6. Pfannenberg, C., et al. Impact of age on the relationships of brown adipose tissue with sex and adiposity in humans. Diabetes. 59 (7), 1789-1793 (2010).
  7. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  8. Vosselman, M. J., et al. Brown adipose tissue activity after a high-calorie meal in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 98 (1), 57-64 (2013).
  9. Hibi, M., et al. Brown adipose tissue is involved in diet-induced thermogenesis and whole-body fat utilization in healthy humans. International Journal of Obesity. 40 (11), 1655-1661 (2016).
  10. Fenzl, A., Kiefer, F. W. Brown adipose tissue and thermogenesis. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 19 (1), 25-37 (2014).
  11. Koksharova, E., et al. The relationship between brown adipose tissue content in supraclavicular fat depots and insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus and prediabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (2), 96-102 (2017).
  12. Habek, N., Kordić, M., Jurenec, F., Dugandžić, A. Infrared thermography, a new method for detection brown adipose tissue activity after a meal in humans. Infrared Physics & Technology. 89, 271-276 (2018).
  13. Lee, P., Ho, K. K. Y. Hot fat in a cool man: Infrared thermography and brown adipose tissue. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13 (1), 92-93 (2011).
  14. Ang, Q. Y., et al. A new method of infrared thermography for quantification of brown adipose tissue activation in healthy adults (TACTICAL): A randomized trial. Journal of Physiological Sciences. 67 (3), 395-406 (2017).
  15. Jang, C., et al. Infrared thermography in the detection of brown adipose tissue in humans. Physiological Reports. 2 (11), 12167 (2014).
  16. Dodd, G. T., et al. Leptin and insulin act on POMC neurons to promote the browning of white fat. Cell. 160 (1-2), 88-104 (2015).
  17. Habek, N., et al. Activation of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis is GC-C dependent. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 472 (3), 405-417 (2020).
  18. Burke, L. K., et al. Sex difference in physical activity, energy expenditure and obesity driven by a subpopulation of hypothalamic POMC neurons. Molecular Metabolism. 5 (3), 245-252 (2016).
  19. Glumer, C., Jorgensen, T., Borch-Johnsen, K. Prevalences of diabetes and impaired glucose regulation in a Danish population: The Inter99 study. Diabetes Care. 26 (8), 2335-2340 (2003).
  20. Sicree, R. A., et al. Differences in height explain gender differences in the response to the oral glucose tolerance test-the AusDiab study. Diabetic Medicine. 25 (3), 296-302 (2008).
  21. van Genugten, R. E., et al. Effects of sex and hormone replacement therapy use on the prevalence of isolated impaired fasting glucose and isolated impaired glucose tolerance in subjects with a family history of type 2 diabetes. Diabetes. 55 (12), 3529-3535 (2006).
  22. Williams, J. W., et al. Gender differences in the prevalence of impaired fasting glycaemia and impaired glucose tolerance in Mauritius. Does sex matter. Diabetic Medicine. 20 (11), 915-920 (2003).
  23. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 215-223 (2013).
  24. Brasil, S., et al. A systematic review on the role of infrared thermography in the brown adipose tissue assessment. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 21 (1), 37-44 (2020).
  25. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
  26. Crane, J. D., Mottillo, E. P., Farncombe, T. H., Morrison, K. M., Steinberg, G. R. A standardized infrared imaging technique that specifically detects UCP1-mediated thermogenesis in vivo. Molecular Metabolism. 3 (4), 490-494 (2014).
  27. Hartwig, V., et al. Multimodal imaging for the detection of brown adipose tissue activation in women: A pilot study using NIRS and infrared thermography. Journal of Healthcare Engineering. 2017, 5986452 (2017).
  28. James, L., et al. The use of infrared thermography in the measurement and characterization of brown adipose tissue activation. Temperature. 5 (2), 147-161 (2018).
  29. Folgueira, C., et al. Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis. Nature Metabolism. 1 (8), 811-829 (2019).
  30. Ratko, M., Habek, N., Kordić, M., Dugandžić, A. The use of infrared technology as a novel approach for studies with female laboratory animals. Croatian Medical Journal. 61 (4), 346-353 (2020).

Tags

Geneeskunde Nummer 187 Thermografie menselijke proefpersonen en proefdieren postprandiale activering van bruin vetweefsel positronemissietomografie computertomografie (PET-CT)
Infraroodthermografie voor de detectie van veranderingen in de activiteit van bruin vetweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kordić, M.,… More

Kordić, M., Dugandžić, J., Ratko, M., Habek, N., Dugandžić, A. Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity. J. Vis. Exp. (187), e64463, doi:10.3791/64463 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter