使用酿酒酵母中的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入测定S相持续时间
Summary
我们描述了两种互补的方案，以使用EdU（一种胸苷类似物）准确确定 酿酒酵母 的S期持续时间，该EdU在 体内 掺入并通过显微镜和流式细胞术使用Click化学进行检测。它可以轻松表征突变体中DNA复制的持续时间和被忽视的复制缺陷。
Abstract
真核DNA复制是一个高度调控的过程，可确保在染色体分离之前正确复制细胞的遗传蓝图。由于DNA合成缺陷是染色体重排的基础，因此监测DNA复制已成为了解基因组不稳定基础的关键。 酿酒酵母 是研究细胞周期调控的经典模型，但关键的DNA复制参数，如S期或S期持续时间的细胞比例，仍然难以确定。该协议在工程TK-hENT1酵母细胞中使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）（胸苷类似物）的短且无毒脉冲，然后通过Click反应进行检测，以允许通过显微镜和流式细胞术在单细胞和群体水平上以高空间和时间分辨率可视化和定量DNA复制。该方法可以识别酵母突变体的S期和细胞周期进程中以前被忽视的缺陷，从而允许表征对确保基因组稳定性至关重要的新参与者。
Introduction
通过有丝分裂的基因组稳定性是通过将一组完整且相等的染色体传递给两个产生的细胞后代来确保的。这依赖于在细胞周期的每个阶段的给定时间内发生的一系列事件的准确完成。在 G 1 中，复制来源是在招募几个许可因素（包括 Cdc61）后获得许可的。在S阶段，全基因组复制从多个活跃的复制起源开始，并由复制机器执行，这些机器聚集在显微镜下可见的灶中，称为复制工厂2。在M期，重复的姐妹染色单体附着并双向定向在有丝分裂纺锤体上，以允许它们分离到有丝分裂细胞3的相对极点。每个阶段的调控、正确完成和持续时间是确保基因组稳定性的关键。事实上，过早退出这些阶段中的任何一个都会导致基因组不稳定。例如，由出芽酵母CDK抑制剂Sic1缺失或G 1细胞周期蛋白过表达诱导的较短的G1将改变随后的S期4，5，6。因此，这些失调，无论是否与复制应激相关，都会导致染色体断裂、重排和错误分离4，5，6。因此，监测S期的持续时间以及更广泛地说，监测细胞周期其他阶段的持续时间对于识别不同突变体和不同应激条件下发生的缺陷可能至关重要。
测量细胞周期阶段持续时间的传统方法包括简单的DNA含量流式细胞术（图1A），并依赖于拟合算法（大多数细胞术软件中可用），用于将群体从1C和2C峰分离为G1，S和G2 + M相级分。然后将分数乘以总体倍增时间7。然而，该方法仅给出估计值，需要在给定级分内均匀的细胞大小分布，并且不适用于同步培养。为了研究哺乳动物细胞中的S期持续时间，已经开发并广泛使用了几种胸苷类似物，包括EdU。它们从细胞外培养基中摄取并被胸苷激酶（以下简称TK）磷酸化，使它们可用于DNA聚合酶，以将它们掺入DNA合成位点（复制，重组，修复）。为了绕过 酿酒 酵母细胞中TK基因的缺失，酵母菌株已被设计为允许单纯疱疹病毒TK8 和人平衡核苷转运蛋白（hENT1）9的稳定和组成性表达。一旦掺入 DNA 中，EdU 就会通过 选择性 Click 反应进行检测，该反应将其炔烃部分化学偶联到叠氮化物修饰的荧光染料10。
本文提供了两种优化的综合协议，用于使用 EdU 对异步和同步 TK-hENT1 工程细胞进行脉冲标记，以便通过显微镜和流式细胞术精确可视化和测量 DNA 复制持续时间和动态，以及细胞周期其他阶段的持续时间，在单细胞和群体水平上具有高空间和时间分辨率。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵母是细胞周期研究的主要模式生物，但其S期的表征长期以来一直受到阻碍，因为它无法结合外源性核苷，如BrdU，其用作DNA复制的示踪剂。为酵母配备高表达的单纯疱疹胸苷激酶（TK）并添加人核苷转运蛋白（hENT）在很大程度上解决了这个问题15，16。与抗BrdU抗体不同，EdU比BrdU更通用，因为它使用小荧光叠氮化物和Click化学进行检测，适用于透化的酵?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢国家研究局（ANR）和癌症研究协会（ARC）向JDD提供博士奖学金，并感谢国家研究机构（ANR）的财政支持（赠款ANR-18-CE12-0018-01）。细胞术和显微镜检查在蒙彼利埃MRI BioCampus成像设施中进行。
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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