出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定
Summary
我々は、in vivoに組み込まれ、顕微鏡およびフローサイトメトリーによってクリックケミストリーを使用して検出されるチミジン類似体であるEdUを使用して、S.cerevisiaeのS期持続時間を正確に決定するための2つの補完的なプロトコルについて説明します。これにより、DNA複製の持続時間や変異体の見落とされた複製欠陥を簡単に特徴付けることができます。
Abstract
真核生物のDNA複製は、染色体分離の前に細胞の遺伝的青写真が正しく複製されることを保証する高度に制御されたプロセスです。DNA合成の欠陥は染色体再配列の根底にあるため、DNA複製のモニタリングは、ゲノム不安定性の基礎を理解するために不可欠になっています。 Saccharomyces cerevisiae は、細胞周期調節を研究するための古典的なモデルですが、S期の細胞の割合やS期の持続時間などの重要なDNA複製パラメータを決定することは依然として困難です。このプロトコルは、チミジン類似体である5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)の短い非毒性パルスを改変されたTK-hENT1酵母細胞で使用し、続いてクリック反応で検出することで、顕微鏡およびフローサイトメトリーによる単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能でDNA複製の視覚化と定量を可能にします。この方法は、酵母変異体のS期および細胞周期進行におけるこれまで見過ごされてきた欠陥を特定し、それによってゲノム安定性を確保するために不可欠な新しいプレーヤーの特性評価を可能にする可能性があります。
Introduction
有糸分裂によるゲノム安定性は、2つの産生された細胞子孫への完全かつ等しい染色体のセットの伝達によって保証される。これは、細胞周期の各段階において所与の時間に起こる一連の事象の正確な完了に依存する。G 1では、複製元は、Cdc61を含むいくつかのライセンス要素の採用時にライセンスされます。S期では、全ゲノム複製は複数のアクティブな複製起点から開始され、複製ファクトリー2と呼ばれる顕微鏡的に見える焦点に集まる複製機械によって実行されます。M期では、複製された姉妹染色分体が有糸分裂紡錘体上に付着し、双配向して、有糸分裂細胞3の反対側の極に分離することを可能にする。各フェーズの調節、適切な完了、および期間は、ゲノムの安定性を確保するための鍵です。実際、これらの段階のいずれかからの時期尚早の終了は、ゲノムの不安定性につながります。例えば、出芽酵母CDK阻害剤Sic1の欠失またはG1サイクリンの過剰発現によって誘導されるより短いG1は、その後のS期4,5,6を変化させるであろう。その結果、複製ストレスに関連するかどうかにかかわらず、これらの規制緩和は、染色体の切断、再配列、および誤分離をもたらします4,5,6。したがって、S期の持続時間、より広義には細胞周期の他の段階の持続時間を監視することは、異なる変異体および異なるストレスの多い条件で発生する欠陥を特定するために重要であり得る。
細胞周期の持続時間を測定する従来の方法には、単純なDNA含有フローサイトメトリー(図1A)が含まれ、1Cおよび2Cピークから集団をG1、S、およびG2 + Mフェーズフラクションに分離するために使用されるフィッティングアルゴリズム(ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能)に依存します。次に、分数に母集団倍増時間7を掛けます。ただし、この方法は推定値のみを提供し、特定のフラクション内で均一な細胞サイズ分布を必要とし、同期培養には適用できません。哺乳類細胞におけるS期持続時間を研究するために、EdUを含むいくつかのチミジン類似体が開発され、広く使用されている。細胞外培地からの取り込みとチミジンキナーゼ(以下TK)によるリン酸化により、DNAポリメラーゼがDNA合成(複製、組換え、修復)の部位に取り込むことができます。 サッカロミセス・セレビシエ 細胞におけるTK遺伝子の不在を回避するために、酵母株は、単純ヘルペスウイルスTK8 およびヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター(hENT1)9の安定かつ構成的発現を可能にするように操作されている。DNAに取り込まれると、EdUは選択的クリック反応 を介して 検出され、そのアルキン部分をアジド修飾蛍光色素10に化学的に結合します。
この論文は、顕微鏡とフローサイトメトリーによって単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能で、DNA複製期間とダイナミクス、および細胞周期の他のフェーズの持続時間を正確に視覚化および測定するために、EdUで非同期および同期TK-hENT1操作細胞をパルス標識するための2つの最適化された包括的なプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵母は細胞周期研究の主要なモデル生物ですが、そのS期の特徴付けは、DNA複製のトレーサーとして使用されるBrdUなどの外因性ヌクレオシドを組み込むことができないために長い間妨げられてきました。酵母に単純ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)の高発現を装備し、ヒトヌクレオシドトランスポーター(hENT)を添加することで、この問題は大部分が解決されました15,16<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、J.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche sur le Cancer(ARC)が博士課程のフェローシップをJ.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche(ANR)に財政支援(助成金ANR-18-CE12-0018-01)として認める。サイトメトリーと顕微鏡検査は、モンペリエMRIバイオキャンパスイメージング施設で実施されました。
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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