사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정
Summary
우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.
Abstract
진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2′-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.
Introduction
유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc61을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장2이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포3의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다. 결과적으로, 복제 스트레스와 관련이 있든 없든 이러한 규제 완화는 염색체 파괴, 재 배열 및 잘못된 분리 4,5,6을 초래합니다. 따라서 S 단계의 지속 기간 및보다 광범위하게는 세포주기의 다른 단계의 지속 시간을 모니터링하는 것은 다른 돌연변이 체 및 다른 스트레스 조건에서 발생하는 결함을 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.
세포 주기 단계 기간을 측정하는 전통적인 방법에는 간단한 DNA 함량 유세포분석(그림 1A)이 포함되며 집단을 1C 및 2C 피크에서 G1, S 및 G2 + M 상 분획으로 분리하는 데 사용되는 피팅 알고리즘(대부분의 세포분석 소프트웨어에서 사용 가능)에 의존합니다. 그런 다음 분수에 인구 배가 시간7을 곱합니다. 그러나 이 방법은 추정된 값만 제공하고 주어진 분획 내에서 균질한 세포 크기 분포가 필요하며 동기화된 배양에는 적용할 수 없습니다. 포유류 세포에서 S- 기 지속 시간을 연구하기 위해 EdU를 포함한 여러 티미 딘 유사체가 개발되어 널리 사용되었습니다. 세포 외 배지로부터의 흡수와 티미 딘 키나아제 (이하 TK라고 함)에 의한 인산화는 DNA 중합 효소가 DNA 합성 (복제, 재조합, 복구) 부위에 이들을 통합 할 수있게한다. 사카로마이세스 세레비지애 세포에서 TK 유전자의 부재를 우회하기 위해 효모 균주는 단순 포진 바이러스 TK8 및 인간 평형 뉴클레오시드 수송체(hENT1)9의 안정적이고 구성적인 발현을 허용하도록 설계되었습니다. 일단 DNA에 통합되면, EdU는 선택적 클릭 반응을 통해 검출되며, 이는 알킨 부분을 아지드-개질된 플루오로크롬10에 화학적으로 결합시킨다.
이 백서는 현미경 및 유세포 분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제 기간 및 역학뿐만 아니라 세포 주기의 다른 단계의 지속 시간을 정확하게 시각화하고 측정하기 위해 EdU를 사용하여 비동기 및 동기식 TK-hENT1 엔지니어링 세포에 대한 두 가지 최적화된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다15,16. EdU는 항 BrdU…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 재정 지원을 위해 JDDBT와 Agence Nationale pour la Recherche (ANR) 및 Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC)를 J.d.DBT에 대한 박사 학위 펠로우십과 ANR(Agence Nationale pour la Recherche)로 인정하고자 합니다(보조금 ANR-18-CE12-0018-01). 세포 분석 및 현미경 검사는 Montpellier MRI BioCampus 이미징 시설에서 수행되었습니다.
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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