Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae
Summary
We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.
Abstract
Eukaryote DNA-replicatie is een sterk gereguleerd proces dat ervoor zorgt dat de genetische blauwdruk van een cel correct wordt gedupliceerd voorafgaand aan chromosoomsegregatie. Aangezien DNA-synthesedefecten ten grondslag liggen aan chromosoomherschikkingen, is het monitoren van DNA-replicatie essentieel geworden om de basis van genoominstabiliteit te begrijpen. Saccharomyces cerevisiae is een klassiek model om celcyclusregulatie te bestuderen, maar belangrijke DNA-replicatieparameters, zoals de fractie van cellen in de S-fase of de S-faseduur, zijn nog steeds moeilijk te bepalen. Dit protocol maakt gebruik van korte en niet-toxische pulsen van 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), een thymidine-analoog, in gemanipuleerde TK-hENT1-gistcellen, gevolgd door de detectie door Click-reactie om de visualisatie en kwantificering van DNA-replicatie met hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie mogelijk te maken. Deze methode kan eerder over het hoofd geziene defecten in de S-fase en celcyclusprogressie van gistmutanten identificeren, waardoor de karakterisering van nieuwe spelers mogelijk wordt die essentieel zijn voor het waarborgen van genoomstabiliteit.
Introduction
Genoomstabiliteit door mitotische deling wordt verzekerd door de overdracht van een volledige en gelijke set chromosomen naar de twee geproduceerde celoudergenen. Dit is afhankelijk van de nauwkeurige voltooiing van een reeks gebeurtenissen die zich in een bepaalde tijd in elke fase van de celcyclus voordoen. In G1 wordt de replicatieoorsprong in licentie gegeven bij de werving van verschillende licentiefactoren, waaronder Cdc61. In de S-fase wordt duplicatie van het hele genoom geïnitieerd vanuit meerdere actieve replicatieoorzaken en uitgevoerd door replicatiemachines die zich verzamelen in microscopisch zichtbare foci genaamd replicatiefabrieken2. In de M-fase worden gedupliceerde zusterchromatiden bevestigd en gebioriënteerd op de mitotische spil om hun segregatie naar de tegenovergestelde polen van de mitotische celmogelijk te maken 3. De regulatie, de juiste voltooiing en de duur van elke fase zijn de sleutel tot genoomstabiliteit. Inderdaad, voortijdige exit uit een van deze fasen leidt tot genoominstabiliteit. Bijvoorbeeld, een kortere G1 geïnduceerd door deletie van de ontluikende gist CDK-remmer Sic1 of door de overexpressie van G1 cyclinen zal de daaropvolgende S-fase 4,5,6 veranderen. Bijgevolg resulteren deze deregulaties, al dan niet geassocieerd met replicatiestress, in chromosoombreuken, herschikkingen en missegregatie 4,5,6. Daarom kan het monitoren van de duur van de S-fase en, meer in het algemeen, de duur van de andere fasen van de celcyclus cruciaal zijn om de defecten te identificeren die optreden in verschillende mutanten en in verschillende stressvolle omstandigheden.
Een traditionele methode voor het meten van de duur van de celcyclusfase omvat eenvoudige DNA-inhoudsstroomcytometrie (figuur 1A) en vertrouwt op een passend algoritme (beschikbaar in de meeste cytometriesoftware) dat wordt gebruikt om de populatie te scheiden in G1-, S- en G2 + M-fasefracties van de 1C- en 2C-pieken. De fracties worden vervolgens vermenigvuldigd met de populatie verdubbelingstijd7. Deze methode geeft echter alleen geschatte waarden, vereist een homogene celgrootteverdeling binnen een bepaalde fractie en is niet van toepassing op gesynchroniseerde culturen. Om de S-faseduur in zoogdiercellen te bestuderen, zijn verschillende thymidine-analogen ontwikkeld en op grote schaal gebruikt, waaronder EdU. Hun opname uit het extracellulaire medium en fosforylering door thymidinekinase (hierna TK genoemd) maken ze beschikbaar voor DNA-polymerasen om ze op te nemen op plaatsen van DNA-synthese (replicatie, recombinatie, reparatie). Om de afwezigheid van het TK-gen in Saccharomyces cerevisiae-cellen te omzeilen, zijn giststammen ontworpen om stabiele en constitutieve expressie van het herpes simplex-virus TK8 en de humane equilibratieve nucleosidetransporter (hENT1) 9 mogelijk te maken. Eenmaal opgenomen in DNA, wordt EdU gedetecteerd via de selectieve Click-reactie, die zijn alkyngroep chemisch koppelt aan azide-gemodificeerde fluorochelen10.
Dit artikel biedt twee geoptimaliseerde uitgebreide protocollen om asynchrone en synchrone TK-hENT1-engineered cellen met EdU te pulseren om de duur en dynamiek van DNA-replicatie nauwkeurig te visualiseren en te meten, evenals de duur van de andere fasen van de celcyclus, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gist is een belangrijk modelorganisme voor celcyclusstudies, maar de karakterisering van de S-fase wordt al lang belemmerd door het onvermogen om exogene nucleosiden op te nemen, zoals BrdU, die worden gebruikt als tracers van DNA-replicatie. Het uitrusten van gist met een hoge expressie van herpes simplex thymidinekinase (TK) en de toevoeging van een humane nucleoside transporter (hENT) heeft dit probleem grotendeels opgelost15,16. EdU is veelzijdiger dan BrdU o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Agence Nationale de la Recherche (ANR) en Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) erkennen voor de doctoraatsbeurzen aan J.d.D.B.T. en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR) voor financiële steun (subsidie ANR-18-CE12-0018-01). Cytometrie en microscopie werden uitgevoerd in de Montpellier MRI BioCampus beeldvormingsfaciliteit.
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Génétique. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
