تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae
Summary
وصفنا بروتوكولين متكاملين لتحديد مدة الطور S بدقة في S. cerevisiae باستخدام EdU ، وهو نظير ثيميدين ، والذي تم دمجه في الجسم الحي واكتشافه باستخدام كيمياء النقر عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. يسمح بالتوصيف السهل لمدة تكرار الحمض النووي وعيوب النسخ المتماثل التي تم التغاضي عنها في الطفرات.
Abstract
تضاعف الحمض النووي حقيقي النواة هو عملية منظمة للغاية تضمن تكرار المخطط الجيني للخلية بشكل صحيح قبل فصل الكروموسومات. نظرا لأن عيوب تخليق الحمض النووي تكمن وراء إعادة ترتيب الكروموسومات ، فقد أصبحت مراقبة تكرار الحمض النووي ضرورية لفهم أساس عدم استقرار الجينوم. Saccharomyces cerevisiae هو نموذج كلاسيكي لدراسة تنظيم دورة الخلية ، ولكن لا يزال من الصعب تحديد معلمات تكرار الحمض النووي الرئيسية ، مثل جزء الخلايا في المرحلة S أو مدة المرحلة S. يستخدم هذا البروتوكول نبضات قصيرة وغير سامة من 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وهو نظير ثيميدين ، في خلايا خميرة TK-hENT1 المهندسة ، متبوعا باكتشافه عن طريق تفاعل النقر للسماح بتصور وقياس تكرار الحمض النووي بدقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. قد تحدد هذه الطريقة العيوب التي تم تجاهلها سابقا في المرحلة S وتطور دورة الخلية لمتحولات الخميرة ، مما يسمح بتوصيف لاعبين جدد ضروريين لضمان استقرار الجينوم.
Introduction
يتم ضمان استقرار الجينوم من خلال الانقسام الانقسامي من خلال نقل مجموعة كاملة ومتساوية من الكروموسومات إلى ذريتي الخلية المنتجتين. يعتمد هذا على الإكمال الدقيق لسلسلة من الأحداث التي تحدث في وقت معين في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. في G 1 ، يتم ترخيص أصول النسخ المتماثل عند توظيف العديد من عوامل الترخيص ، بما في ذلك Cdc61. في المرحلة S ، يبدأ تكرار الجينوم الكامل من أصول النسخ المتماثل النشطة المتعددة ويتم تنفيذه بواسطة أجهزة النسخ المتماثل التي تتجمع في بؤر مرئية مجهريا تسمى مصانع النسخ المتماثل2. في المرحلة M ، يتم ربط الكروماتيدات الشقيقة المتضاعفة وثنائية الاتجاه على المغزل الانقسامي للسماح بفصلها إلى القطبين المتقابلين للخلية الانقسامية3. يعد التنظيم والإكمال المناسب ومدة كل مرحلة أمرا أساسيا لضمان استقرار الجينوم. في الواقع ، يؤدي الخروج المبكر من أي من هذه المراحل إلى عدم استقرار الجينوم. على سبيل المثال ، فإن G 1 الأقصر الناجم عن حذف مثبط CDK الخميرة الناشئ Sic1 أو عن طريق الإفراط في التعبير عن سيكلين G1 سيغير المرحلة S اللاحقة4،5،6. وبالتالي ، فإن عمليات إلغاء التنظيم هذه ، المرتبطة أو غير المرتبطة بإجهاد النسخ المتماثل ، تؤدي إلى كسر الكروموسومات وإعادة ترتيبها والفصل الخاطئ4،5،6. لذلك ، قد تكون مراقبة مدة المرحلة S ، وعلى نطاق أوسع ، مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية أمرا حاسما لتحديد العيوب التي تحدث في الطفرات المختلفة وفي الظروف المجهدة المختلفة.
تتضمن الطريقة التقليدية لقياس مدة مرحلة دورة الخلية القياس الخلوي البسيط لتدفق محتوى الحمض النووي (الشكل 1 أ) وتعتمد على خوارزمية مناسبة (متوفرة في معظم برامج قياس الخلايا) تستخدم لفصل السكان إلى كسور طور G1 و S و G2 + M من قمم 1C و 2C. ثم يتم ضرب الكسور في وقت مضاعفة المجتمع الإحصائي7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تعطي قيما تقديرية فقط ، وتتطلب توزيعا متجانسا لحجم الخلية داخل جزء معين ، ولا تنطبق على الثقافات المتزامنة. لدراسة مدة المرحلة S في خلايا الثدييات ، تم تطوير العديد من نظائر الثيميدين واستخدامها على نطاق واسع ، بما في ذلك EdU. إن امتصاصها من الوسط خارج الخلية والفسفرة بواسطة ثايميدين كيناز (المشار إليه فيما يلي باسم TK) يجعلها متاحة لبوليميراز الحمض النووي لدمجها في مواقع تخليق الحمض النووي (النسخ المتماثل ، إعادة التركيب ، الإصلاح). لتجاوز غياب جين TK في خلايا Saccharomyces cerevisiae ، تم تصميم سلالات الخميرة للسماح بالتعبير المستقر والتأسيسي لفيروس الهربس البسيط TK8 وناقل النوكليوزيد البشري المتوازن (hENT1)9. بمجرد دمجه في الحمض النووي ، يتم اكتشاف EdU عبر تفاعل النقر الانتقائي ، والذي يقترن كيميائيا بمزيج الألكين الخاص به إلى الفلوروكرومات المعدلة بالأزيد10.
تقدم هذه الورقة بروتوكولين شاملين محسنين لتسمية الخلايا المهندسة TK-hENT1 غير المتزامنة والمتزامنة مع EdU من أجل تصور وقياس مدة وديناميكيات تكرار الحمض النووي بدقة ، بالإضافة إلى مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية ، مع دقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخميرة هي كائن نموذجي رئيسي لدراسات دورة الخلية ، ومع ذلك فإن توصيف طورها S قد أعاق منذ فترة طويلة بسبب عدم قدرتها على دمج النيوكليوسيدات الخارجية ، مثل BrdU ، والتي تستخدم كمتتبعات لتكرار الحمض النووي. إن تجهيز الخميرة بتعبير عال عن الهربس البسيط ثيميدين كيناز (TK) وإضافة ناقل نيوكليوزيد بش?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالوكالة الوطنية للبحوث (ANR) وجمعية البحوث حول السرطان (ARC) للحصول على زمالات الدكتوراه إلى JD D.D.B.T. والوكالة الوطنية للبحوث (ANR) للحصول على الدعم المالي (منحة ANR-18-CE12-0018-01). تم إجراء القياس الخلوي والفحص المجهري في مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي في مونبلييه.
Materials
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100–812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Génétique. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
