体外评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性
Summary
我们介绍了四种使用 体外 技术评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性的方法。这些方法可以适用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与各种微生物物种的相互作用。
Abstract
纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性以前已在临床和环境环境以及消费品中探索过。然而，所使用的实验方法和材料缺乏一致性，最终导致了相互矛盾的结果，即使在相同纳米结构类型和细菌种类的研究中也是如此。对于希望在产品设计中使用纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员来说，这些相互矛盾的数据限制了它们在临床环境中的使用。
为了应对这一困境，在本文中，我们提出了四种不同的方法来确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了它们在不同场景中的适用性。调整一致的方法有望产生可重复的数据，这些数据可以在研究中进行比较，并针对不同的纳米结构类型和微生物物种实施。我们介绍了两种确定纳米颗粒抗菌活性的方法和两种纳米结构表面抗菌活性的方法。
对于纳米颗粒，直接共培养方法可用于确定纳米颗粒的最小抑制和最小杀菌浓度，直接暴露培养方法可用于评估纳米颗粒暴露引起的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，直接培养方法用于确定与纳米结构表面间接和直接接触的细菌的活力，并且聚焦接触暴露方法用于检查纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时要考虑的 体外 研究设计的关键实验变量。所有这些方法的成本都相对较低，采用相对容易掌握和可重复的技术以实现一致性，并且适用于广泛的纳米结构类型和微生物物种。
Introduction
仅在美国，每年就有 170 万人发生医院获得性感染 （HAI），其中每 17 例感染中就有 1 例导致死亡1。此外，据估计，HAI的治疗费用每年从280亿美元到450亿美元不等1，2。这些 HAI 主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）3，4 和铜绿假单胞菌 4 为主，它们通常从慢性伤口感染中分离出来，通常需要广泛的治疗和时间才能产生良好的患者预后。
在过去的几十年中，已经开发了多种抗生素类别来治疗与这些和其他致病菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗MRSA，其他革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染以及分枝杆菌属感染5。在1990年代，为了有效治疗越来越多的结核分枝杆菌感染，额外的药物与利福霉素类似物联合使用以提高其有效性。然而，大约 5% 的结核分枝杆菌病例仍然对利福平5，6 耐药，并且人们越来越关注多重耐药细菌7。 目前，单独使用抗生素可能不足以治疗HAI，这引发了对替代抗菌疗法的持续寻找1。
重金属，如银（Ag）8，9，10和金（Au）11，以及陶瓷，如二氧化钛（TiO 2）12和氧化锌（ZnO）13，以纳米颗粒（NP）形式（分别为AgNP，AuNP，TiO2 NP和ZnONP）已被检查其抗菌活性，并已被确定为潜在的抗生素替代品。此外，生物可吸收材料，如镁合金（Mg合金）14，15，16，氧化镁纳米颗粒17，18，19，20，21和氢氧化镁纳米颗粒[分别为nMgO和nMg（OH）2]22，23，24，也进行了检查。然而，以前对纳米颗粒的抗菌研究使用了不一致的材料和研究方法，导致数据难以或不可能比较，有时本质上是矛盾的18，19。例如，银纳米颗粒的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）在不同的研究中差异很大。Ipe等人25评估了平均粒径为~26nm的AgNPs的抗菌活性，以确定MIC对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抵抗力。鉴定出的铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC分别为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和10 μg/mL。相比之下，Parvekar等人26评估了平均粒径为5nm的AgNPs。在这种情况下，发现AgNP MIC和0.625 mg / mL的MBC对金黄色葡萄球菌有效。此外，Loo等人27评估了尺寸为4.06nm的AgNP。当大肠杆菌暴露于这些纳米颗粒时，报告的MIC和MBC为7.8μg/ mL。最后，Ali等人28研究了平均尺寸为18 nm的球形AgNPs的抗菌性能。当铜绿假单胞菌、大肠杆菌和MRSA暴露于这些纳米颗粒时，MIC的鉴定分别为27 μg/mL、36 μg/mL、27 μg/mL和36 μg/mL，MBC分别为36 μg/mL、42 μg/mL和30 μg/mL。
尽管近几十年来纳米颗粒的抗菌活性已被广泛研究和报道，但用于直接比较研究的材料和研究方法没有标准。出于这个原因，我们提出了两种方法，直接共培养方法（方法A）和直接暴露方法（方法B），以表征和比较纳米颗粒的抗菌活性，同时保持材料和方法的一致性。
除纳米颗粒外，还研究了纳米结构表面的抗菌活性。这些包括碳基材料，如石墨烯纳米片、碳纳米管和石墨29，以及纯镁和镁合金。这些材料中的每一种都表现出至少一种抗菌机制，包括碳基材料对细胞膜的物理损伤，以及当镁降解时通过释放活性氧（ROS）对代谢过程或DNA的损害。此外，当锌（Zn）和钙（Ca）结合形成镁合金时，镁基体晶粒尺寸的细化增强，与仅镁样品相比，这导致细菌对基材表面的粘附减少14。为了证明抗菌活性，我们提出了直接培养方法（方法C），该方法通过定量具有直接和间接表面接触的细菌菌落形成单位（CFU）来确定细菌随时间推移对纳米结构材料及其周围的粘附。
表面纳米结构的几何形状，包括尺寸、形状和方向，可能会影响材料的杀菌活性。例如，Lin等人16 通过阳极氧化和电泳沉积（EPD）在镁衬底表面制备了不同的纳米结构MgO层。在 体外暴露于纳米结构表面一段时间后，与未处理的Mg相比， 金黄色葡萄球菌 的生长显着减少。这表明纳米结构表面对细菌粘附的效力高于未处理的金属镁表面。为了揭示各种纳米结构表面抗菌性能的不同机制，本文讨论了一种确定感兴趣区域内细胞-表面相互作用的聚焦接触暴露方法（方法D）。
本文的目的是介绍四种适用于不同纳米颗粒、纳米结构表面和微生物物种的体外方法。我们讨论了每种方法的关键考虑因素，以产生一致、可重复的数据以提高可比性。具体地，直接共培养方法17和直接暴露方法用于检查纳米颗粒的抗菌特性。通过直接共培养法，可以确定单个物种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（MIC和MBC90-99.99），并且可以确定多个物种的最有效浓度（MPC）。通过直接暴露方法，纳米颗粒在最小抑制浓度下的抑菌或杀菌作用可以通过随时间推移的实时光密度读数来表征。直接培养方法14适用于直接和间接检查与纳米结构表面接触的细菌。最后，提出聚焦接触曝光16方法，通过直接应用细菌和表征细胞-纳米结构界面上的细菌生长来检查纳米结构表面上特定区域的抗菌活性。该方法从日本工业标准JIS Z 2801：200016修改而来，旨在关注微生物-表面相互作用，并排除微生物培养中大宗样品降解对抗菌活性的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提出了四种体外方法（A-D）来表征纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性。虽然这些方法中的每一种都量化了细菌随时间推移对纳米材料的生长和活力，但用于测量初始细菌接种密度、生长和活力随时间变化的方法存在一些差异。其中三种方法，直接共培养方法（A）17，直接培养方法（C）14和聚焦接触暴露方法（D）16，通过计算每单位体积<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢美国国家科学基金会（NSF CPET奖1512764和NSF PIRE 1545852），美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631），加州大学（UC）摄政教师发展奖学金，研究种子资助委员会（Huinan Liu）和加州大学河滨分校研究生研究指导计划授予Patricia Holt-Torres的资助。作者感谢加州大学河滨分校高级显微镜和微量分析中央设施（CFAMM）为使用SEM / EDS和Perry Cheung博士使用XRD提供的帮助。作者还要感谢Morgan Elizabeth Nator和Samhitha Tumkur在实验和数据分析方面的帮助。本文中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点，并不一定反映美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的观点。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
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