시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가
Summary
시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
Abstract
은, 산화 아연, 이산화 티타늄 및 산화 마그네슘과 같은 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성은 이전에 임상 및 환경 환경과 소모성 식품에서 탐구되었습니다. 그러나 사용된 실험 방법과 재료의 일관성 부족은 동일한 나노 구조 유형과 박테리아 종에 대한 연구 사이에서도 상충되는 결과를 낳았습니다. 나노 구조를 제품 설계에서 첨가제 또는 코팅으로 사용하려는 연구자의 경우 이러한 상충되는 데이터는 임상 환경에서의 활용을 제한합니다.
이 딜레마에 맞서기 위해 이 기사에서는 나노 입자와 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 네 가지 방법을 제시하고 다양한 시나리오에서 적용 가능성에 대해 논의합니다. 일관된 방법을 적용하면 연구 전반에 걸쳐 비교하고 다양한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 대해 구현할 수 있는 재현 가능한 데이터로 이어질 것으로 예상됩니다. 나노입자의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법과 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법을 소개합니다.
나노 입자의 경우, 직접 공동 배양 방법을 사용하여 나노 입자의 최소 억제 및 최소 살균 농도를 결정할 수 있으며, 직접 노출 배양 방법을 사용하여 나노 입자 노출로 인한 실시간 정균 대 살균 활성을 평가할 수 있습니다. 나노 구조 표면의 경우, 직접 배양 방법은 나노 구조 표면과 간접적으로 직접 접촉하는 박테리아의 생존 가능성을 결정하는 데 사용되며, 초점 접촉 노출 방법은 나노 구조 표면의 특정 영역에서 항균 활성을 검사하는 데 사용됩니다. 우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 특성을 결정할 때 시험관 내 연구 설계를 위해 고려해야 할 주요 실험 변수에 대해 논의합니다. 이러한 모든 방법은 상대적으로 비용이 저렴하고 비교적 마스터하기 쉽고 일관성을 위해 반복 가능한 기술을 사용하며 광범위한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 적용할 수 있습니다.
Introduction
미국에서만 매년 170만 명이 병원 획득 감염(HAI)을 일으키며, 이 중 17건 중 1건이 사망에 이른다1. 또한 HAI의 치료 비용은 연간 280억 달러에서 450억 달러에 이르는 것으로 추정됩니다 1,2. 이러한 HAI는 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)3,4 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)4에 의해 우세하며, 이들은 일반적으로 만성 상처 감염으로부터 분리되며, 일반적으로 유리한 환자 결과를 얻기 위해 광범위한 치료와 시간이 필요합니다.
지난 수십 년 동안 이러한 박테리아 및 기타 병원성 박테리아와 관련된 감염을 치료하기 위해 여러 항생제 종류가 개발되었습니다. 예를 들어, 리파마이신 유사체는 MRSA, 다른 그람 양성 및 그람 음성 감염, 및 Mycobacterium spp. 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다5. 1990년대에는 증가하는 M. tuberculosis 감염을 효과적으로 치료하기 위해 추가 약물을 리파마이신 유사체와 결합하여 효과를 높였습니다. 그러나, 결핵균 감염자의 약 5%는리팜피신에 내성이 남아 있으며5,6, 다제내성균에 대한 우려가 증가하고 있다7. 현재, 항생제 단독으로는 HAI 치료에 충분하지 않을 수 있으며, 이로 인해 대체 항균 요법에 대한 지속적인 연구가 촉발되었다1.
은(Ag)8,9,10 및 금(Au)11과 같은 중금속과 이산화티타늄(TiO2)12 및 산화아연(ZnO)13과 같은 세라믹은 나노입자(NP) 형태(각각 AgNP, AuNP, TiO2 NP 및 ZnONP)는 항균 활성에 대해 조사되었으며 잠재적인 항생제 대안으로 확인되었습니다. 또한, 마그네슘 합금 (Mg 합금) 14,15,16, 산화 마그네슘 나노 입자 17,18,19,20,21 및 수산화 마그네슘 나노 입자 [각각 nMgO 및 nMg (OH) 2]22,23,24 , 또한 조사되었습니다. 그러나 나노 입자에 대한 이전의 항균 연구는 일관되지 않은 재료와 연구 방법을 사용하여 비교하기 어렵거나 불가능하고 때로는 본질적으로 모순되는 데이터를 생성했습니다18,19. 예를 들어,은 나노 입자의 최소 억제 농도 (MIC)와 최소 살균 농도 (MBC)는 다른 연구에서 크게 달랐다. Ipe et al.25는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 MIC를 결정하기 위해 ~26nm의 평균 입자 크기를 갖는 AgNP의 항균 활성을 평가했습니다. 녹농균, 대장균, 황색포도상구균 및 MRSA에 대해 확인된 MIC는 각각 2μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL 및 10μg/mL였습니다. 대조적으로, Parvekar et al.26은 평균 입자 크기가 5nm인 AgNP를 평가했습니다. 이 경우 AgNP MIC와 0.625mg/mL의 MBC가 S. 아우레우스에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, Loo et al.27은 4.06 nm 크기의 AgNPs를 평가하였다. 대장균이 이러한 나노 입자에 노출되었을 때 MIC와 MBC는 7.8 μg / mL로보고되었습니다. 마지막으로 Ali et al.28은 평균 크기가 18nm인 구형 AgNP의 항균 특성을 조사했습니다. 녹농균, 대장균 및 MRSA가 이들 나노입자에 노출되었을 때, MIC는 각각 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL 및 36 μg/mL에서 확인되었고, MBC는 각각 36 μg/mL, 42 μg/mL 및 30 μg/mL에서 확인되었다.
나노 입자의 항균 활성은 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 보고되었지만 연구 전반에 걸쳐 직접 비교할 수 있는 재료 및 연구 방법에 대한 표준은 없습니다. 이러한 이유로 우리는 재료와 방법을 일관되게 유지하면서 나노 입자의 항균 활성을 특성화하고 비교하기 위해 직접 공동 배양 방법 (방법 A)과 직접 노출 방법 (방법 B)의 두 가지 방법을 제시합니다.
나노 입자 외에도 나노 구조 표면도 항균 활성에 대해 조사되었습니다. 여기에는 그래핀 나노시트, 탄소 나노튜브, 흑연29와 같은 탄소 기반 재료와 순수 Mg 및 Mg 합금이 포함됩니다. 이들 물질 각각은 탄소 기반 물질에 의해 세포막에 가해지는 물리적 손상 및 Mg가 분해될 때 활성 산소종(ROS)의 방출을 통한 대사 과정 또는 DNA 손상을 포함하여 적어도 하나의 항균 메커니즘을 나타냈습니다. 또한, 아연(Zn)과 칼슘(Ca)이 Mg 합금의 형성에 결합될 때, Mg 매트릭스 입자 크기의 미세화가 향상되고, 이는 Mg-단독 샘플(14)에 비해 기판 표면에 대한 박테리아 접착의 감소로 이어진다. 항균 활성을 입증하기 위해 직접 및 간접 표면 접촉을 통한 박테리아 집락 형성 단위(CFU)의 정량화를 통해 시간 경과에 따른 나노 구조 물질 위와 주변의 박테리아 부착을 결정하는 직접 배양 방법(방법 C)을 제시합니다.
크기, 모양 및 방향을 포함한 표면의 나노 구조의 기하학은 재료의 살균 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, Lin et al.16 은 양극 산화 및 전기 영동 증착 (EPD)을 통해 Mg 기판의 표면에 상이한 나노 구조 MgO 층을 제조했다. 시험관 내에서 나노구조화된 표면에 일정 기간 노출된 후, S. 아우레우스 의 성장은 처리되지 않은 Mg에 비해 실질적으로 감소되었다. 이것은 처리되지 않은 금속 Mg 표면에 비해 박테리아 접착에 대한 나노 구조 표면의 더 큰 효능을 나타냅니다. 다양한 나노 구조 표면의 항균 특성의 다양한 메커니즘을 밝히기 위해 관심 영역 내에서 세포-표면 상호 작용을 결정하는 집속 접촉 노출 방법(방법 D)이 이 기사에서 논의됩니다.
이 기사의 목적은 서로 다른 나노 입자, 나노 구조 표면 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 제시하는 것입니다. 비교 가능성을 위해 일관되고 재현 가능한 데이터를 생성하기 위해 각 방법에 대한 주요 고려 사항에 대해 논의합니다. 구체적으로, 나노입자의 항균성을 조사하기 위해 직접공배양법(17)과 직접노광법이 사용된다. 직접 공동 배양 방법을 통해 개별 종에 대해 최소 억제 및 최소 살균 농도(각각 MIC 및 MBC90-99.99)를 결정할 수 있으며 여러 종에 대해 가장 강력한 농도(MPC)를 결정할 수 있습니다. 직접 노출 방법을 통해 최소 억제 농도에서 나노 입자의 정균 또는 살균 효과는 시간 경과에 따른 실시간 광학 밀도 판독값으로 특성화할 수 있습니다. 직접 배양14 방법은 나노 구조 표면과 직접 및 간접적으로 접촉하는 박테리아를 검사하는 데 적합합니다. 마지막으로, 박테리아의 직접 적용과 세포-나노 구조 계면에서의 박테리아 성장의 특성화를 통해 나노 구조 표면의 특정 영역의 항균 활성을 조사하기 위해 초점 접촉 노출16 방법이 제시됩니다. 이 방법은 일본 산업 표준 JIS Z 2801:200016에서 수정되었으며 미생물-표면 상호 작용에 초점을 맞추고 미생물 배양에서 벌크 샘플 분해가 항균 활성에 미치는 영향을 배제하기 위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 특성화하기 위해 4 가지 시험관 내 방법 (AD)을 제시했습니다. 이러한 각 방법은 나노 물질에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 박테리아 성장 및 생존력을 정량화하지만 시간 경과에 따른 초기 박테리아 파종 밀도, 성장 및 생존력을 측정하는 데 사용되는 방법에는 약간의 차이가 있습니다. 이 방법 중 세 가지, 직접 공동 배양 방법 (A) <sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학교 (UC) 리전트 교수 개발 펠로우쉽, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 Patricia Holt-Torres에게 수여 된 UC-Riverside 대학원 연구 멘토십 프로그램 보조금. 저자는 SEM/EDS 사용을 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis)과 XRD 사용을 위해 Perry Cheung 박사가 제공한 지원에 감사드립니다. 저자는 또한 실험 및 데이터 분석에 도움을 준 Morgan Elizabeth Nator 및 Samhitha Tumkur에게 감사를 표합니다. 이 기사에 표현된 모든 의견, 발견, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 국립 과학 재단 또는 국립 보건원의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
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