in vitroでのナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性の評価
Summary
ナノ粒子やナノ構造表面の抗菌活性を in vitro 技術を用いて評価する4つの方法を紹介します。これらの方法は、さまざまなナノ粒子およびナノ構造表面と広範囲の微生物種との相互作用を研究するために適応させることができる。
Abstract
銀、酸化亜鉛、二酸化チタン、酸化マグネシウムなどのナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性は、臨床および環境環境および消耗品で以前に調査されてきました。しかし、使用される実験方法と材料の一貫性の欠如は、同じナノ構造タイプと細菌種の研究の間でさえ、矛盾する結果に至りました。ナノ構造を製品設計の添加剤またはコーティングとして採用したい研究者にとって、これらの相反するデータは臨床現場での利用を制限します。
このジレンマに立ち向かうために、この記事では、ナノ粒子とナノ構造表面の抗菌活性を決定するための4つの異なる方法を提示し、さまざまなシナリオでのそれらの適用性について説明します。一貫した方法を適応させることで、研究間で比較し、さまざまなナノ構造タイプや微生物種に対して実装できる再現性のあるデータにつながることが期待されます。ナノ粒子の抗菌活性を決定する2つの方法と、ナノ構造表面の抗菌活性を決定する2つの方法を紹介します。
ナノ粒子の場合、直接共培養法を使用してナノ粒子の最小阻害濃度および最小殺菌濃度を決定し、直接暴露培養法を使用して、ナノ粒子曝露に起因するリアルタイムの静菌活性と殺菌活性を評価することができます。ナノ構造表面の場合、直接培養法を使用してナノ構造表面に間接的および直接接触する細菌の生存率を決定し、集束接触暴露法を使用してナノ構造表面の特定の領域での抗菌活性を調べます。ナノ粒子とナノ構造表面の抗菌特性を決定する際に in vitro 研究デザインのために考慮すべき重要な実験変数について説明します。これらの方法はすべて比較的低コストであり、習得が比較的簡単で一貫性のために再現可能な技術を採用しており、幅広いナノ構造タイプと微生物種に適用できます。
Introduction
米国だけでも、毎年170万人が院内感染(HAI)を発症し、これらの感染症の17人に1人が死亡しています1。さらに、HAIの治療費は年間280億ドルから450億ドルの範囲であると推定されています1,2。これらのHAIは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)3,4および緑膿菌4が優勢であり、これらは一般的に慢性創傷感染症から分離され、通常、良好な患者転帰を生み出すために広範な治療と時間を必要とします。
過去数十年にわたって、これらおよび他の病原性細菌に関連する感染症を治療するために、複数の抗生物質クラスが開発されてきました。例えば、リファマイシン類似体は、MRSA、他のグラム陽性およびグラム陰性感染症、ならびにマイコバクテリウム属感染症の治療に使用されています5。1990年代には、増加する結核菌感染症を効果的に治療するために、追加の薬物をリファマイシン類似体と組み合わせてその有効性を高めました。しかし、結核菌症例の約5%がリファンピシン5,6に耐性を残しており、多剤耐性菌7に対する懸念が高まっています。 現在、抗生物質だけではHAIの治療には十分ではない可能性があり、これにより代替抗菌療法の継続的な探索が引き起こされています1。
銀(Ag)8,9,10および金(Au)11などの重金属、およびナノ粒子(NP)形態の二酸化チタン(TiO 2)12および酸化亜鉛(ZnO)13のようなセラミックス(それぞれAgNP、AuNP、TiO2 NP、およびZnONP)は、それらの抗菌活性について調べられ、潜在的な抗生物質の代替品として同定されている。さらに、マグネシウム合金(Mg合金)14,15,16、酸化マグネシウムナノ粒子17,18,19,20,21、水酸化マグネシウムナノ粒子[それぞれnMgOおよびnMg(OH)2]などの生体吸収性材料22,23,24、も検討されている。しかし、ナノ粒子の以前の抗菌研究では、一貫性のない材料と研究方法を使用していたため、比較が困難または不可能であり、本質的に矛盾するデータが得られました18,19。例えば、銀ナノ粒子の最小発育阻止濃度(MIC)および最小殺菌濃度(MBC)は、異なる研究において有意に異なっていた。Ipeら25は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するMICを決定するために、平均粒径~26nmのAgNPの抗菌活性を評価した。緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、MRSAの同定されたMICは、それぞれ2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、および10 μg/mLでした。対照的に、Parvekarら26は、平均粒径5nmのAgNPを評価した。この場合、AgNP MICと0.625 mg / mLのMBCが黄色ブドウ球菌に対して有効であることがわかりました。さらに、Looら27は、4.06nmのサイズのAgNPを評価した。大腸菌をこれらのナノ粒子に曝露すると、MICおよびMBCは7.8μg/mLと報告されました。最後に、Aliら28は、平均サイズが18nmの球状AgNPの抗菌特性を調べました。緑膿菌、大腸菌、MRSAをこれらのナノ粒子に曝露すると、MICはそれぞれ27 μg/mL、36 μg/mL、27 μg/mL、36 μg/mL、MBCはそれぞれ36 μg/mL、42 μg/mL、30 μg/mLと同定されました。
ナノ粒子の抗菌活性はここ数十年で広く研究され報告されてきましたが、研究間の直接比較を可能にするために使用される材料と研究方法の基準はありません。このため、直接共培養法(A法)と直接暴露法(B法)の2つの方法を提示し、材料と方法の一貫性を保ちながらナノ粒子の抗菌活性を特徴付け、比較します。
ナノ粒子に加えて、ナノ構造表面も抗菌活性について調べられています。これらには、単層カーボンナノシート、カーボンナノチューブ、グラファイト29などの炭素ベースの材料、ならびに純粋なMgおよびMg合金が含まれる。これらの各材料は、炭素系材料によって細胞膜に課せられる物理的損傷や、Mgが分解する際の活性酸素種(ROS)の放出による代謝過程またはDNAの損傷など、少なくとも1つの抗菌メカニズムを示しています。さらに、亜鉛(Zn)とカルシウム(Ca)を組み合わせてMg合金を形成すると、Mgマトリックスの粒径の微細化が促進され、Mgのみのサンプル14と比較して、基板表面への細菌接着が減少します。抗菌活性を実証するために、直接的および間接的な表面接触を伴う細菌コロニー形成単位(CFU)の定量を通じて、ナノ構造材料上およびナノ構造材料周辺の細菌接着を経時的に決定する直接培養法(方法C)を紹介します。
サイズ、形状、配向など、表面上のナノ構造の形状は、材料の殺菌活性に影響を与える可能性があります。例えば、Linら16 は、陽極酸化および電気泳動堆積(EPD)によって、Mg基板の表面に異なるナノ構造MgO層を作製した。 in vitroでナノ構造表面への一定期間の曝露後、 黄色ブドウ球菌 の成長は、未処理のMgと比較して大幅に減少した。これは、未処理の金属Mg表面に対する細菌接着に対するナノ構造表面のより大きな効力を示した。本稿では、様々なナノ構造表面の抗菌特性のさまざまなメカニズムを明らかにするために、対象領域内の細胞表面相互作用を決定する集束接触露光法(方法D)について説明します。
この記事の目的は、さまざまなナノ粒子、ナノ構造表面、および微生物種に適用できる4つのin vitroメソッドを提示することです。比較可能性のために一貫性のある再現性のあるデータを生成するための各方法の主な考慮事項について説明します。具体的には、ナノ粒子の抗菌性を調べるために、直接共培養法17および直接露光法が用いられる。直接共培養法により、最小発育阻止濃度と最小殺菌濃度(それぞれMICとMBC90-99.99)を個々の種について決定でき、最も強力な濃度(MPC)を複数の種について決定できます。直接暴露法により、最小阻害濃度でのナノ粒子の静菌または殺菌効果を、経時的なリアルタイムの光学濃度測定値によって特徴付けることができます。直接培養14法は、ナノ構造表面に直接的および間接的に接触している細菌を検査するのに適している。最後に、細菌の直接適用と細胞-ナノ構造界面での細菌増殖の特性評価を通じて、ナノ構造表面上の特定の領域の抗菌活性を調べるために、集束接触曝露16法を提示します。この方法は、日本工業規格JIS Z 2801:200016から修正されたもので、微生物と表面の相互作用に着目し、微生物培養におけるバルク試料分解が抗菌活性に及ぼす影響を排除することを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性を特徴付けるための4つのin vitro法(A-D)を提示しました。これらの方法のそれぞれは、ナノ材料に応答して経時的な細菌の増殖および生存率を定量化するが、初期の細菌播種密度、増殖、および経時的な生存率を測定するために使用される方法にはいくつかのばらつきが存在する。これらの方法のうちの3つ、直接共培養法(A)17、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、米国国立科学財団(NSF CBET賞1512764およびNSF PIRE 1545852)、国立衛生研究所(NIH NIDCR 1R03DE028631)、カリフォルニア大学(UC)リージェンツ教員開発フェローシップ、研究シード助成金委員会(Huinan Liu)、およびパトリシアホルトトーレスに授与されたUC-リバーサイド大学院研究メンターシッププログラム助成金からの財政的支援に感謝します。著者らは、カリフォルニア大学リバーサイド校の先端顕微鏡および微量分析のための中央施設(CFAMM)がSEM / EDSの使用について、およびペリー・チャン博士がXRDの使用について提供した支援に感謝しています。著者らはまた、実験とデータ分析を支援してくれたモーガン・エリザベス・ネイターとサムヒサ・トゥムクールに感謝したい。この記事に記載されている意見、調査結果、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしも国立科学財団または国立衛生研究所の見解を反映しているわけではありません。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
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