Evaluering af antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader in vitro

Summary

Vi introducerer fire metoder til at evaluere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter ved hjælp af in vitro-teknikker . Disse metoder kan tilpasses til at studere interaktionerne mellem forskellige nanopartikler og nanostrukturerede overflader med en bred vifte af mikrobielle arter.

Abstract

De antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader, såsom sølv, zinkoxid, titandioxid og magnesiumoxid, er tidligere blevet undersøgt i kliniske og miljømæssige omgivelser og i forbrugsvarer. Manglende konsistens i de anvendte forsøgsmetoder og materialer har imidlertid kulmineret i modstridende resultater, selv blandt undersøgelser af de samme nanostrukturtyper og bakteriearter. For forskere, der ønsker at anvende nanostrukturer som additiv eller belægning i et produktdesign, begrænser disse modstridende data deres udnyttelse i kliniske omgivelser.

For at konfrontere dette dilemma præsenterer vi i denne artikel fire forskellige metoder til at bestemme nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter og diskuterer deres anvendelighed i forskellige scenarier. Tilpasning af konsistente metoder forventes at føre til reproducerbare data, der kan sammenlignes på tværs af undersøgelser og implementeres for forskellige nanostrukturtyper og mikrobielle arter. Vi introducerer to metoder til at bestemme nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter og to metoder til nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter.

For nanopartikler kan metoden med direkte samdyrkning anvendes til at bestemme de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer af nanopartikler, og dyrkningsmetoden med direkte eksponering kan anvendes til at vurdere bakteriostatisk versus bakteriedræbende aktivitet i realtid som følge af nanopartikeleksponering. For nanostrukturerede overflader anvendes metoden med direkte dyrkning til at bestemme levedygtigheden af bakterier, der indirekte og direkte er i kontakt med nanostrukturerede overflader, og metoden med fokuseret kontakteksponering anvendes til at undersøge antimikrobiel aktivitet på et bestemt område af en nanostruktureret overflade. Vi diskuterer vigtige eksperimentelle variabler, der skal overvejes til in vitro-undersøgelsesdesign , når de antimikrobielle egenskaber af nanopartikler og nanostrukturerede overflader bestemmes. Alle disse metoder er relativt billige, anvender teknikker, der er relativt lette at mestre og gentages for konsistens, og er anvendelige på en bred vifte af nanostrukturtyper og mikrobielle arter.

Introduction

I USA alene udvikler 1,7 millioner individer en hospitalserhvervet infektion (HAI) årligt, hvor en ud af hver 17 af disse infektioner resulterer i død¹. Derudover anslås det, at behandlingsomkostningerne for HAI’er varierer fra $ 28 milliarder til $ 45 milliarder årligt ^1,2. Disse HAI’er domineres af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)^3,4 og Pseudomonas aeruginosa^4, som almindeligvis isoleres fra kroniske sårinfektioner og normalt kræver omfattende behandling og tid for at producere et gunstigt patientresultat.

I løbet af de sidste årtier er der udviklet flere antibiotikaklasser til behandling af infektioner relateret til disse og andre patogene bakterier. For eksempel er rifamycinanaloger blevet anvendt til behandling af MRSA, andre gram-positive og gram-negative infektioner og Mycobacterium spp. infektioner⁵. I 1990’erne, for effektivt at behandle et stigende antal M. tuberculosis-infektioner, blev yderligere lægemidler kombineret med rifamycinanaloger for at øge deres effektivitet. Imidlertid forbliver ca. 5% af M. tuberculosis-tilfældene resistente over forrifampicin^5,6, og der er stigende bekymring for multiresistente bakterier⁷. I øjeblikket er brugen af antibiotika alene muligvis ikke tilstrækkelig til behandling af infektioner erhvervet i sundhedsvæsenet, og dette har fremkaldt en løbende søgning efter alternative antimikrobielle behandlingsformer¹.

Tungmetaller, såsom sølv (Ag)^8,9,10 og guld (Au)11, og keramik, såsom titandioxid (TiO 2)12 og zinkoxid (ZnO)¹³, i nanopartikel (NP) form (henholdsvis AgNP, AuNP, TiO₂ NP og ZnONP) er blevetundersøgt for deres antimikrobielle aktiviteter og er blevet identificeret som potentielle antibiotikaalternativer. Derudover bioresorberbare materialer, såsom magnesiumlegeringer (Mg-legeringer)14,15,16, magnesiumoxidnanopartikler 17,18,19,20,21 og magnesiumhydroxidnanopartikler [henholdsvis nMgO og nMg(OH)_2]^22,23,24, er også blevet undersøgt. De tidligere antimikrobielle undersøgelser af nanopartikler anvendte imidlertid inkonsekvente materialer og forskningsmetoder, hvilket resulterede i data, der er vanskelige eller umulige at sammenligne og undertiden er modstridende i naturen^18,19. For eksempel varierede den mindste hæmmende koncentration (MIC) og den minimale bakteriedræbende koncentration (MBC) af sølvnanopartikler signifikant i forskellige undersøgelser. Ipe et al.25 evaluerede de antibakterielle aktiviteter af AgNP’er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på ~ ²⁶ nm for at bestemme MIC’erne mod gram-positive og gram-negative bakterier. De identificerede MIC for P. aeruginosa, E. coli, S. aureus og MRSA var henholdsvis 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml og 10 μg/ml. I modsætning hertil evaluerede Parvekar et ^al.26 AgNP’er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på 5 nm. I dette tilfælde viste AgNP MIC og en MBC på 0,625 mg / ml sig at være effektive mod S. aureus. Derudover evaluerede Loo et ^al.27 AgNP’er med en størrelse på 4,06 nm. Når E. coli blev eksponeret for disse nanopartikler, blev MIC og MBC rapporteret ved 7,8 μg/ml. Endelig undersøgte Ali et ^al.28 de antibakterielle egenskaber af sfæriske AgNP’er med en gennemsnitlig størrelse på 18 nm. Når P. aeruginosa, E. coli og MRSA blev udsat for disse nanopartikler, blev MIC identificeret ved henholdsvis 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml og 36 μg / ml, og MBC blev identificeret ved henholdsvis 36 μg / ml, 42 μg / ml og 30 μg / ml.

Selvom nanopartiklers antibakterielle aktivitet er blevet grundigt undersøgt og rapporteret i de seneste årtier, er der ingen standard for de materialer og forskningsmetoder, der anvendes til at muliggøre direkte sammenligninger på tværs af undersøgelser. Af denne grund præsenterer vi to metoder, den direkte samkulturmetode (metode A) og den direkte eksponeringsmetode (metode B), til at karakterisere og sammenligne nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter, samtidig med at materialerne og metoderne holdes konsistente.

Ud over nanopartikler er nanostrukturerede overflader også blevet undersøgt for antibakterielle aktiviteter. Disse omfatter kulstofbaserede materialer, såsom grafennanoark, kulstofnanorør og grafit²⁹ samt rene Mg- og Mg-legeringer. Hvert af disse materialer har udvist mindst en antibakteriel mekanisme, herunder fysisk skade på cellemembraner af kulstofbaserede materialer og skade på metaboliske processer eller DNA gennem frigivelse af reaktive iltarter (ROS), når Mg nedbrydes. Når zink (Zn) og calcium (Ca) kombineres i dannelsen af Mg-legeringer, forbedres forfiningen af Mg-matrixkornstørrelsen, hvilket fører til en reduktion i bakteriel vedhæftning til substratoverflader sammenlignet med Mg-only-prøver¹⁴. For at demonstrere antibakteriel aktivitet præsenterer vi den direkte kulturmetode (metode C), som bestemmer bakteriel vedhæftning på og omkring nanostrukturerede materialer over tid gennem kvantificering af bakteriekolonidannende enheder (CFU’er) med direkte og indirekte overfladekontakt.

Nanostrukturernes geometri på overflader, herunder størrelse, form og orientering, kan påvirke materialernes bakteriedræbende aktiviteter. For eksempel fremstillede Lin et ^al.16 forskellige nanostrukturerede MgO-lag på overfladerne af Mg-substrater gennem anodisering og elektroforetisk aflejring (EPD). Efter en periode med eksponering for den nanostrukturerede overflade in vitro blev væksten af S. aureus væsentligt reduceret sammenlignet med ubehandlet Mg. Dette indikerede en større styrke af den nanostrukturerede overflade mod bakteriel vedhæftning versus den ubehandlede metalliske Mg-overflade. For at afsløre de forskellige mekanismer for de antibakterielle egenskaber ved forskellige nanostrukturerede overflader diskuteres en fokuseret kontakteksponeringsmetode (metode D), der bestemmer celle-overfladeinteraktionerne inden for interesseområdet, i denne artikel.

Formålet med denne artikel er at præsentere fire in vitro-metoder, der kan anvendes på forskellige nanopartikler, nanostrukturerede overflader og mikrobielle arter. Vi diskuterer vigtige overvejelser for hver metode for at producere konsistente, reproducerbare data til sammenlignelighed. Specifikt anvendes metoden med direkte samkultur¹⁷ og metoden med direkte eksponering til undersøgelse af nanopartiklers antimikrobielle egenskaber. Gennem den direkte co-kulturmetode kan de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer (henholdsvis MIC og MBC_90-99,99) bestemmes for individuelle arter_, og den mest potente koncentration (MPC) kan bestemmes for flere arter. Gennem metoden med direkte eksponering kan nanopartiklers bakteriostatiske eller bakteriedræbende virkninger ved minimale hæmmende koncentrationer karakteriseres ved realtidsaflæsninger af optisk densitet over tid. Direct Culture^14-metoden er velegnet til at undersøge bakterier direkte og indirekte i kontakt med nanostrukturerede overflader. Endelig præsenteres metoden med fokuseret kontakteksponering¹⁶ for at undersøge den antibakterielle aktivitet af et specifikt område på en nanostruktureret overflade gennem direkte anvendelse af bakterier og karakterisering af bakterievækst ved celle-nanostrukturgrænsefladen. Denne metode er modificeret fra den japanske industristandard JIS Z 2801:2000¹⁶ og har til formål at fokusere på mikrobe-overfladeinteraktioner og udelukke virkningerne af nedbrydning af bulkprøver i mikrobiel kultur på antimikrobielle aktiviteter.

Protocol

For at præsentere metoderne til direkte samkultur og direkte eksponering bruger vi magnesiumoxidnanopartikler (nMgO) som modelmateriale til at demonstrere bakterielle interaktioner. For at præsentere den direkte kultur og fokuserede kontakteksponeringsmetoder bruger vi en Mg-legering med nanostrukturerede overflader som eksempler. 1. Sterilisering af nanomaterialer BEMÆRK: Alle nanomaterialer skal steriliseres eller desinficeres inden mikrobiel kul…

Representative Results

Identifikationen af den antibakterielle aktivitet af magnesiumoxidnanopartikler og nanostrukturerede overflader er blevet præsenteret ved hjælp af fire in vitro-metoder , der kan anvendes på tværs af forskellige materialetyper og mikrobielle arter. Metode A og metode B undersøger bakterieaktiviteter, når de udsættes for nanopartikler i en lagfase (metode A) og logaritmisk fase (metode B) i en varighed på 24 timer eller længere. Metode A giver resultater vedrørende MIC og MBC…

Discussion

Vi har præsenteret fire in vitro metoder (A-D) til at karakterisere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antibakterielle aktiviteter. Mens hver af disse metoder kvantificerer bakterievækst og levedygtighed over tid som reaktion på nanomaterialer, findes der en vis variation i de metoder, der anvendes til at måle den oprindelige bakterielle såtæthed, vækst og levedygtighed over tid. Tre af disse metoder, metoden med direkte samkultur (A)¹⁷, metoden med direkte kultur (C)1…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2