इन विट्रो में नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन
Summary
हम इन विट्रो तकनीकों का उपयोग करके नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए चार तरीकों का परिचय देते हैं। इन विधियों को माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विभिन्न नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों, जैसे चांदी, जस्ता ऑक्साइड, टाइटेनियम डाइऑक्साइड और मैग्नीशियम ऑक्साइड की रोगाणुरोधी गतिविधियों को पहले नैदानिक और पर्यावरणीय सेटिंग्स और उपभोग्य खाद्य उत्पादों में खोजा गया है। हालांकि, प्रयोगात्मक तरीकों और उपयोग की जाने वाली सामग्रियों में स्थिरता की कमी ने परस्पर विरोधी परिणामों में परिणत किया है, यहां तक कि एक ही नैनोस्ट्रक्चर प्रकार और जीवाणु प्रजातियों के अध्ययन के बीच भी। शोधकर्ताओं के लिए जो उत्पाद डिजाइन में एक योजक या कोटिंग के रूप में नैनोस्ट्रक्चर को नियोजित करना चाहते हैं, ये परस्पर विरोधी डेटा नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग को सीमित करते हैं।
इस दुविधा का सामना करने के लिए, इस लेख में, हम नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए चार अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करते हैं, और विभिन्न परिदृश्यों में उनकी प्रयोज्यता पर चर्चा करते हैं। सुसंगत तरीकों को अपनाने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की उम्मीद है जिसे अध्ययनों में तुलना की जा सकती है और विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर प्रकारों और माइक्रोबियल प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। हम नैनोकणों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए दो तरीकों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की रोगाणुरोधी गतिविधियों के लिए दो तरीकों का परिचय देते हैं।
नैनोकणों के लिए, नैनोकणों के न्यूनतम निरोधात्मक और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता को निर्धारित करने के लिए प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि का उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्यक्ष एक्सपोजर कल्चर विधि का उपयोग नैनोपार्टिकल एक्सपोजर से उत्पन्न वास्तविक समय बैक्टीरियोस्टेटिक बनाम जीवाणुनाशक गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के लिए, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से और सीधे नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के संपर्क में बैक्टीरिया की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि का उपयोग नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के एक विशिष्ट क्षेत्र पर रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए किया जाता है। हम नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के रोगाणुरोधी गुणों का निर्धारण करते समय इन विट्रो अध्ययन डिजाइन के लिए विचार करने के लिए प्रमुख प्रयोगात्मक चर पर चर्चा करते हैं। ये सभी विधियां अपेक्षाकृत कम लागत वाली हैं, ऐसी तकनीकों को नियोजित करती हैं जो मास्टर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हैं और स्थिरता के लिए दोहराने योग्य हैं, और नैनोस्ट्रक्चर प्रकारों और माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती हैं।
Introduction
अकेले अमेरिका में, 1.7 मिलियन व्यक्ति सालाना अस्पताल-अधिग्रहित संक्रमण (एचएआई) विकसित करते हैं, इनमें से प्रत्येक 17 संक्रमणों में से एक के परिणामस्वरूप मृत्युहो जाती है। इसके अलावा, यह अनुमान लगाया गया है कि एचएआई के लिए उपचार लागत $ 28 बिलियन से $ 45 बिलियन सालाना 1,2 तक है। ये एचएआई मेथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) 3,4 और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा4 द्वारा प्रबल हैं, जो आमतौर पर पुराने घाव संक्रमण से अलग होते हैं और आमतौर पर एक अनुकूल रोगी परिणाम उत्पन्न करने के लिए व्यापक उपचार और समय की आवश्यकता होती है।
पिछले कई दशकों में, इन और अन्य रोगजनक बैक्टीरिया से संबंधित संक्रमणों के इलाज के लिए कई एंटीबायोटिक वर्ग विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, रिफैमाइसिन एनालॉग का उपयोग एमआरएसए, अन्य ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक संक्रमण, और माइकोबैक्टीरियम एसपीपी संक्रमण5 के इलाज के लिए किया गया है। 1990 के दशक में, एम तपेदिक संक्रमणों की बढ़ती संख्या का प्रभावी ढंग से इलाज करने के लिए, उनकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए अतिरिक्त दवाओं को रिफैमाइसिन एनालॉग के साथ जोड़ा गया था। हालांकि, लगभग 5% एम तपेदिक के मामलेरिफैम्पिसिन5,6 के प्रतिरोधी रहते हैं, और बहु-दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया7 के बारे में चिंता बढ़ रही है। वर्तमान में, अकेले एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग एचएआई के उपचार में पर्याप्त नहीं हो सकता है, और इसने वैकल्पिक रोगाणुरोधी उपचारों के लिए चल रही खोज को उकसायाहै।
भारी धातुओं, जैसे चांदी (एजी) 8,9,10 और सोना (एयू) 11, और सिरेमिक, जैसे टाइटेनियम डाइऑक्साइड (टीआईओ 2)12 और जिंक ऑक्साइड (जेडएनओ)13, नैनोपार्टिकल (एनपी) रूप में (एजीएनपी, एयूएनपी, टीआईओ 2 एनपी, और जेडएनओएनपी, क्रमशः) उनकी रोगाणुरोधी गतिविधियों के लिए जांच की गई है और संभावित एंटीबायोटिक विकल्पों के रूप में पहचान की गई है। इसके अलावा, मैग्नीशियम मिश्र धातु (मिलीग्राम मिश्र धातु) 14,15,16, मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोकणों 17,18,19,20,21, और मैग्नीशियम हाइड्रॉक्साइड नैनोकणों [एनएमजीओ और एनएमजी (ओएच)2, क्रमशः] 22,23,24 जैसे जैव-पुनरुत्पादक सामग्री।इसकी भी जांच की गई है। हालांकि, नैनोकणों के पिछले रोगाणुरोधी अध्ययनों ने असंगत सामग्री और अनुसंधान विधियों का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप डेटा की तुलना करना मुश्किल या असंभव है और कभी-कभीप्रकृति में विरोधाभासी होते हैं। उदाहरण के लिए, चांदी के नैनोकणों की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) और न्यूनतम जीवाणुनाशक एकाग्रता (एमबीसी) विभिन्न अध्ययनों में काफी भिन्न होती है। आईपीई एट अल .25 ने ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ एमआईसी निर्धारित करने के लिए ~ 26 एनएम के औसत कण आकार के साथ एजीएनपी की जीवाणुरोधी गतिविधियों का मूल्यांकन किया। पी. एरुगिनोसा, ई. कोलाई, एस. ऑरियस और एमआरएसए के लिए पहचाने गए एमआईसी क्रमशः 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL और 10 μg/mL थे। इसके विपरीत, परवेकर एट अल .26 ने 5 एनएम के औसत कण आकार के साथ एजीएनपी का मूल्यांकन किया। इस उदाहरण में, एजीएनपी एमआईसी और 0.625 मिलीग्राम / एमएल का एमबीसी एस ऑरियस के खिलाफ प्रभावी पाया गया। इसके अलावा, लू एट अल .27 ने 4.06 एनएम के आकार के साथ एजीएनपी का मूल्यांकन किया। जब ई कोलाई इन नैनोकणों के संपर्क में था, तो एमआईसी और एमबीसी को 7.8 μg / mL पर रिपोर्ट किया गया था। अंत में, अली एट अल .28 ने 18 एनएम के औसत आकार के साथ गोलाकार एजीएनपी के जीवाणुरोधी गुणों की जांच की। जब पी. एरुगिनोसा, ई. कोलाई, और एमआरएसए को इन नैनोकणों के संपर्क में लाया गया, तो एमआईसी की पहचान क्रमशः 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL, और 36 μg/mL पर की गई, और MBC की पहचान क्रमशः 36 μg/mL, 42 μg/mL और 30 μg/mL पर की गई।
यद्यपि हाल के दशकों के दौरान नैनोकणों की जीवाणुरोधी गतिविधि का बड़े पैमाने पर अध्ययन और रिपोर्ट किया गया है, लेकिन अध्ययनों में प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और अनुसंधान विधियों के लिए कोई मानक नहीं है। इस कारण से, हम सामग्री और विधियों को सुसंगत रखते हुए नैनोकणों की रोगाणुरोधी गतिविधियों को चिह्नित करने और तुलना करने के लिए दो विधियों, प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि (विधि ए), और प्रत्यक्ष जोखिम विधि (विधि बी) को प्रस्तुत करते हैं।
नैनोकणों के अलावा, जीवाणुरोधी गतिविधियों के लिए नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की भी जांच की गई है। इनमें ग्रेफीन नैनोशीट्स, कार्बन नैनोट्यूब और ग्रेफाइट29 के साथ-साथ प्योर एमजी और एमजी मिश्र धातु जैसी कार्बन आधारित सामग्री शामिल हैं। इन सामग्रियों में से प्रत्येक ने कम से कम एक जीवाणुरोधी तंत्र का प्रदर्शन किया है, जिसमें कार्बन-आधारित सामग्रियों द्वारा कोशिका झिल्ली पर लगाए गए शारीरिक नुकसान और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की रिहाई के माध्यम से चयापचय प्रक्रियाओं या डीएनए को नुकसान शामिल है। इसके अलावा, जब जिंक (जेडएन) और कैल्शियम (सीए) को एमजी मिश्र धातुओं के निर्माण में जोड़ा जाता है, तो एमजी मैट्रिक्स अनाज के आकार का शोधन बढ़ाया जाता है, जिससे एमजी-केवल नमूने14 की तुलना में सब्सट्रेट सतहों पर बैक्टीरिया के आसंजन में कमी आती है। जीवाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन करने के लिए, हम प्रत्यक्ष संस्कृति विधि (विधि सी) प्रस्तुत करते हैं, जो प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सतह संपर्क के साथ बैक्टीरिया कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की मात्रा का ठहराव के माध्यम से समय के साथ नैनोस्ट्रक्चर्ड सामग्रियों पर और उसके आसपास बैक्टीरिया आसंजन निर्धारित करता है।
आकार, आकार और अभिविन्यास सहित सतहों पर नैनोस्ट्रक्चर की ज्यामिति, सामग्री की जीवाणुनाशक गतिविधियों को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, लिन एट अल.16 ने एनोडाइजेशन और इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव (ईपीडी) के माध्यम से एमजी सब्सट्रेट्स की सतहों पर विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर्ड एमजीओ परतों का निर्माण किया। विट्रो में नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह के संपर्क में आने की अवधि के बाद, गैर-उपचारित एमजी की तुलना में एस ऑरियस की वृद्धि काफी कम हो गई थी। इसने बैक्टीरिया के आसंजन बनाम गैर-उपचारित धातु एमजी सतह के खिलाफ नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह की अधिक शक्ति का संकेत दिया। विभिन्न नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के जीवाणुरोधी गुणों के विभिन्न तंत्रों को प्रकट करने के लिए, एक केंद्रित-संपर्क एक्सपोजर विधि (विधि डी) जो रुचि के क्षेत्र के भीतर सेल-सतह इंटरैक्शन को निर्धारित करती है, इस लेख में चर्चा की गई है।
इस लेख का उद्देश्य चार इन विट्रो विधियों को प्रस्तुत करना है जो विभिन्न नैनोकणों, नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों और माइक्रोबियल प्रजातियों पर लागू होते हैं। हम तुलनात्मकता के लिए सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक विधि के लिए महत्वपूर्ण विचारों पर चर्चा करते हैं। विशेष रूप से, नैनोकणों के रोगाणुरोधी गुणों की जांच के लिए प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि17 और प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि का उपयोग किया जाता है। प्रत्यक्ष सह-संस्कृति विधि के माध्यम से, न्यूनतम निरोधात्मक और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता (एमआईसी और एमबीसी90-99.99, क्रमशः) व्यक्तिगत प्रजातियों के लिए निर्धारित की जा सकती है, और कई प्रजातियों के लिए सबसे शक्तिशाली एकाग्रता (एमपीसी) निर्धारित की जा सकती है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर विधि के माध्यम से, न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता पर नैनोकणों के बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक प्रभाव को समय के साथ वास्तविक समय ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग द्वारा चित्रित किया जा सकता है। प्रत्यक्ष संस्कृति14 विधि नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों के संपर्क में सीधे और अप्रत्यक्ष रूप से बैक्टीरिया की जांच के लिए उपयुक्त है। अंत में, फोकस्ड-कॉन्टैक्ट एक्सपोज़र16 विधि बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग और सेल-नैनोस्ट्रक्चर इंटरफ़ेस पर बैक्टीरिया के विकास के लक्षण वर्णन के माध्यम से एक नैनोस्ट्रक्चर्ड सतह पर एक विशिष्ट क्षेत्र की जीवाणुरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए प्रस्तुत की जाती है। यह विधि जापानी औद्योगिक मानक जेआईएस जेड 2801: 200016 से संशोधित है, और इसका उद्देश्य माइक्रोब-सतह इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित करना और रोगाणुरोधी गतिविधियों पर माइक्रोबियल संस्कृति में थोक नमूना गिरावट के प्रभावों को बाहर करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने नैनोकणों और नैनोस्ट्रक्चर्ड सतहों की जीवाणुरोधी गतिविधियों को चिह्नित करने के लिए चार इन विट्रो विधियों (ए-डी) को प्रस्तुत किया है। जबकि इनमें से प्रत्येक विधि नैनोमटेरियल्स के जवाब में समय ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अमेरिकी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी पुरस्कार 1512764 और एनएसएफ पीआईआरई 1545852), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच एनआईडीसीआर 1आर03डीई028631), कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूसी) रीजेंट्स फैकल्टी डेवलपमेंट फैलोशिप, रिसर्च सीड ग्रांट (हुइनन लियू) पर समिति और पेट्रीसिया होल्ट-टोरेस को दिए गए यूसी-रिवरसाइड ग्रेजुएट रिसर्च मेंटरशिप प्रोग्राम ग्रांट से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं। लेखक एसईएम /ईडीएस के उपयोग के लिए यूसी-रिवरसाइड में सेंट्रल फैसिलिटी फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी एंड माइक्रोएनालिसिस (सीएफएएमएम) और एक्सआरडी के उपयोग के लिए डॉ पेरी चेउंग द्वारा प्रदान की गई सहायता की सराहना करते हैं। लेखक प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए मॉर्गन एलिजाबेथ नेटर और संहिता तुमकुर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस लेख में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन या राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के विचारों को प्रतिबिंबित करें।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
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