Avaliação da atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas in vitro

Summary

Apresentamos quatro métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas usando técnicas in vitro . Estes métodos podem ser adaptados para estudar as interações de diferentes nanopartículas e superfícies nanoestruturadas com uma ampla gama de espécies microbianas.

Abstract

As atividades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas, como prata, óxido de zinco, dióxido de titânio e óxido de magnésio, têm sido exploradas anteriormente em ambientes clínicos e ambientais e em produtos alimentícios consumíveis. No entanto, a falta de consistência nos métodos experimentais e materiais utilizados tem culminado em resultados conflitantes, mesmo entre estudos dos mesmos tipos de nanoestruturas e espécies bacterianas. Para pesquisadores que desejam empregar nanoestruturas como aditivo ou revestimento em um projeto de produto, esses dados conflitantes limitam sua utilização em ambientes clínicos.

Para enfrentar esse dilema, neste artigo, apresentamos quatro diferentes métodos para determinar as atividades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas, e discutimos sua aplicabilidade em diferentes cenários. Espera-se que a adaptação de métodos consistentes leve a dados reprodutíveis que possam ser comparados entre estudos e implementados para diferentes tipos de nanoestruturas e espécies microbianas. Apresentamos dois métodos para determinar as atividades antimicrobianas de nanopartículas e dois métodos para as atividades antimicrobianas de superfícies nanoestruturadas.

Para nanopartículas, o método de co-cultura direta pode ser usado para determinar as concentrações inibitórias mínimas e bactericidas mínimas de nanopartículas, e o método de cultura de exposição direta pode ser usado para avaliar a atividade bacteriostática versus bactericida em tempo real resultante da exposição a nanopartículas. Para superfícies nanoestruturadas, o método de cultura direta é usado para determinar a viabilidade de bactérias indiretamente e diretamente em contato com superfícies nanoestruturadas, e o método de exposição de contato focado é usado para examinar a atividade antimicrobiana em uma área específica de uma superfície nanoestruturada. Discutimos as principais variáveis experimentais a serem consideradas para o planejamento de estudos in vitro na determinação das propriedades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas. Todos esses métodos são de custo relativamente baixo, empregam técnicas relativamente fáceis de dominar e repetíveis para consistência, e são aplicáveis a uma ampla gama de tipos de nanoestruturas e espécies microbianas.

Introduction

Somente nos EUA, 1,7 milhão de indivíduos desenvolvem uma infecção hospitalar adquirida (IRAS) anualmente, sendo que uma em cada 17 dessas infecções resulta em morte¹. Além disso, estima-se que os custos do tratamento das IRAS variem de US$ 28 bilhões a US$ 45 bilhões anuais ^1,2. Essas IACS são predominantes por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)^3,4 e Pseudomonas aeruginosa4^, que são comumente isoladas de infecções crônicas de feridas operatórias e geralmente requerem tratamento extenso e tempo para produzir uma evolução favorável do paciente.

Ao longo das últimas décadas, várias classes de antibióticos foram desenvolvidas para tratar infecções relacionadas a essas e outras bactérias patogênicas. Por exemplo, análogos da rifamicina têm sido usados para tratar MRSA, outras infecções gram-positivas e gram-negativas e infecções por Mycobacterium ^spp.5. Na década de 1990, para tratar efetivamente um número crescente de infecções por M. tuberculosis, drogas adicionais foram combinadas com análogos da rifamicina para aumentar sua eficácia. Entretanto, cerca de 5% dos casos de M. tuberculosis permanecem resistentes àrifampicina^5,6, e há uma preocupação crescente com bactérias multirresistentes⁷. Atualmente, o uso isolado de antibióticos pode não ser suficiente no tratamento das IRASs, o que tem provocado uma busca contínua por terapias antimicrobianas alternativas¹.

Metais pesados, como prata (Ag)8,9,10 e ouro (Au)11, e cerâmicas, como dióxido de titânio (TiO 2)12 e óxido de zinco (ZnO)¹³, na forma de nanopartículas (NP) (AgNP, AuNP, TiO₂ NPe ZnONP, respectivamente) têm sido examinados quanto às suas atividades antimicrobianas e têm sido identificados como potenciais alternativas antibióticas. Além disso, materiais bioreabsorvíveis, como ligas de magnésio (ligas de Mg)14,15,16, nanopartículas de óxido de magnésio17,18,19,20,21 e nanopartículas de hidróxido de magnésio [nMgO e nMg(OH)₂, respectivamente]^22,23,24, também foram examinados. No entanto, os estudos antimicrobianos prévios de nanopartículas utilizaram materiais e métodos de pesquisa inconsistentes, resultando em dados difíceis ou impossíveis de comparar e, por vezes, de natureza contraditória^18,19. Por exemplo, a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) das nanopartículas de prata variaram significativamente em diferentes estudos. Ipe et ^al.25 avaliaram a atividade antibacteriana de AgNPs com tamanho médio de partícula de ~26 nm para determinar as CIMs contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. As CIMs identificadas para P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA foram 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL, respectivamente. Em contraste, Parvekar et ^al.26 avaliaram AgNPs com tamanho médio de partícula de 5 nm. Neste caso, a CIM de AgNP e uma CBM de 0,625 mg/mL mostraram-se eficazes contra S. aureus. Além disso, Loo et ^al.27 avaliaram AgNPs com tamanho de 4,06 nm. Quando E. coli foi exposta a essas nanopartículas, a CIM e a CBM foram relatadas a 7,8 μg/mL. Finalmente, Ali et ^al.28 investigaram as propriedades antibacterianas de AgNPs esféricas com tamanho médio de 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA foram expostas a essas nanopartículas, a CIM foi identificada a 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL e 36 μg/mL, respectivamente, e a CBM foi identificada a 36 μg/mL, 42 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente.

Embora a atividade antibacteriana das nanopartículas tenha sido extensivamente estudada e relatada durante as últimas décadas, não há um padrão para os materiais e métodos de pesquisa usados para permitir comparações diretas entre os estudos. Por esta razão, apresentamos dois métodos, o método de co-cultivo direto (método A) e o método de exposição direta (método B), para caracterizar e comparar as atividades antimicrobianas de nanopartículas, mantendo os materiais e métodos consistentes.

Além das nanopartículas, superfícies nanoestruturadas também têm sido examinadas quanto a atividades antibacterianas. Estes incluem materiais à base de carbono, como nanofolhas de grafeno, nanotubos de carbono e grafite²⁹, bem como ligas puras de Mg e Mg. Cada um desses materiais exibiu pelo menos um mecanismo antibacteriano, incluindo danos físicos impostos às membranas celulares por materiais à base de carbono e danos a processos metabólicos ou DNA através da liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) quando o Mg se degrada. Além disso, quando zinco (Zn) e cálcio (Ca) são combinados na formação de ligas de Mg, o refinamento do tamanho de grão da matriz de Mg é aumentado, o que leva a uma redução na adesão bacteriana às superfícies do substrato em comparação com amostras somente de Mg¹⁴. Para demonstrar a atividade antibacteriana, apresentamos o método de cultura direta (método C), que determina a adesão bacteriana sobre e ao redor de materiais nanoestruturados ao longo do tempo através da quantificação de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFCs) com contato superficial direto e indireto.

A geometria das nanoestruturas nas superfícies, incluindo o tamanho, a forma e a orientação, pode influenciar as atividades bactericidas dos materiais. Por exemplo, Lin et ^al.16 fabricaram diferentes camadas nanoestruturadas de MgO nas superfícies de substratos de Mg por anodização e deposição eletroforética (EPD). Após um período de exposição à superfície nanoestruturada in vitro, o crescimento de S. aureus foi substancialmente reduzido em comparação com o Mg não tratado. Isso indicou uma maior potência da superfície nanoestruturada contra a adesão bacteriana em relação à superfície metálica não tratada com Mg. Para revelar os diferentes mecanismos das propriedades antibacterianas de várias superfícies nanoestruturadas, um método de exposição por contato focado (método D) que determina as interações célula-superfície dentro da área de interesse é discutido neste artigo.

O objetivo deste artigo é apresentar quatro métodos in vitro aplicáveis a diferentes nanopartículas, superfícies nanoestruturadas e espécies microbianas. Discutimos as principais considerações para cada método para produzir dados consistentes e reprodutíveis para comparabilidade. Especificamente, o método de co-cultura direta¹⁷ e o método de exposição direta são usados para examinar as propriedades antimicrobianas de nanopartículas. Através do método de co-cultivo direto, as concentrações inibitórias mínimas e bactericidas mínimas (CIM e CBM_90-99,99, respectivamente) podem ser determinadas para espécies individuais_, e a concentração mais potente (CPM) pode ser determinada para várias espécies. Através do método de exposição direta, os efeitos bacteriostáticos ou bactericidas das nanopartículas em concentrações inibitórias mínimas podem ser caracterizados por leituras de densidade óptica em tempo real ao longo do tempo. O método de cultura direta¹⁴ é adequado para examinar bactérias direta e indiretamente em contato com superfícies nanoestruturadas. Finalmente, o método focused-contact^{exposure 16} é apresentado para examinar a atividade antibacteriana de uma área específica em uma superfície nanoestruturada através da aplicação direta de bactérias e da caracterização do crescimento bacteriano na interface célula-nanoestrutura. Este método é modificado a partir da norma industrial japonesa JIS Z 2801:2000¹⁶, e destina-se a focar nas interações micróbio-superfície e excluir os efeitos da degradação da amostra em massa em cultura microbiana sobre as atividades antimicrobianas.

Protocol

Para apresentar os métodos de co-cultivo direto e exposição direta, usamos nanopartículas de óxido de magnésio (nMgO) como material modelo para demonstrar interações bacterianas. Para apresentar os métodos de cultura direta e exposição por contato focado, usamos uma liga de Mg com superfícies nanoestruturadas como exemplos. 1. Esterilização de nanomateriais NOTA: Todos os nanomateriais devem ser esterilizados ou desinfetados antes da cul…

Representative Results

A identificação da atividade antibacteriana de nanopartículas de óxido de magnésio e superfícies nanoestruturadas foi apresentada usando quatro métodos in vitro que são aplicáveis em diferentes tipos de materiais e espécies microbianas. O método A e o método B examinam as atividades bacterianas quando expostas a nanopartículas em uma fase lag (método A) e fase logarítmica (método B) por uma duração de 24 h ou mais. O método A fornece resultados referentes à CIM e C…

Discussion

Apresentamos quatro métodos in vitro (A-D) para caracterizar as atividades antibacterianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas. Embora cada um desses métodos quantifique o crescimento e a viabilidade bacteriana ao longo do tempo em resposta aos nanomateriais, existe alguma variação nos métodos usados para medir a densidade, o crescimento e a viabilidade iniciais da semeadura bacteriana ao longo do tempo. Três desses métodos, o método de co-cultura direta (A)¹⁷, o m?…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2