Vi introducerar fyra metoder för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor med hjälp av in vitro-tekniker . Dessa metoder kan anpassas för att studera interaktioner mellan olika nanopartiklar och nanostrukturerade ytor med ett brett spektrum av mikrobiella arter.
De antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor, såsom silver, zinkoxid, titandioxid och magnesiumoxid, har tidigare undersökts i kliniska och miljömässiga miljöer och i förbrukningsbara livsmedelsprodukter. Bristen på konsekvens i de experimentella metoder och material som används har dock kulminerat i motstridiga resultat, även bland studier av samma nanostrukturtyper och bakteriearter. För forskare som vill använda nanostrukturer som tillsats eller beläggning i en produktdesign begränsar dessa motstridiga data deras användning i kliniska miljöer.
För att konfrontera detta dilemma presenterar vi i denna artikel fyra olika metoder för att bestämma de antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor och diskutera deras tillämplighet i olika scenarier. Anpassning av konsekventa metoder förväntas leda till reproducerbara data som kan jämföras mellan studier och implementeras för olika nanostrukturtyper och mikrobiella arter. Vi introducerar två metoder för att bestämma de antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och två metoder för de antimikrobiella aktiviteterna hos nanostrukturerade ytor.
För nanopartiklar kan den direkta samodlingsmetoden användas för att bestämma de minsta hämmande och minsta bakteriedödande koncentrationerna av nanopartiklar, och den direkta exponeringsodlingsmetoden kan användas för att bedöma bakteriostatisk kontra bakteriedödande aktivitet i realtid till följd av exponering för nanopartiklar. För nanostrukturerade ytor används direktodlingsmetoden för att bestämma livskraften hos bakterier som indirekt och direkt kommer i kontakt med nanostrukturerade ytor, och exponeringsmetoden med fokuserad kontakt används för att undersöka antimikrobiell aktivitet på ett specifikt område på en nanostrukturerad yta. Vi diskuterar viktiga experimentella variabler att överväga för in vitro-studiedesign när man bestämmer de antimikrobiella egenskaperna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor. Alla dessa metoder är relativt billiga, använder tekniker som är relativt lätta att behärska och repeterbara för konsistens och är tillämpliga på ett brett spektrum av nanostrukturtyper och mikrobiella arter.
Bara i USA utvecklar 1,7 miljoner individer en sjukhusförvärvad infektion (VRI) årligen, med en av 17 av dessa infektioner som leder till dödsfall1. Dessutom uppskattas att behandlingskostnaderna för VRI varierar från 28 miljarder dollar till 45 miljarder dollar årligen 1,2. Dessa vårdrelaterade infektioner domineras av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 och Pseudomonas aeruginosa4, som vanligtvis isoleras från kroniska sårinfektioner och vanligtvis kräver omfattande behandling och tid för att ge ett gynnsamt patientresultat.
Under de senaste decennierna har flera antibiotikaklasser utvecklats för att behandla infektioner relaterade till dessa och andra patogena bakterier. Till exempel har rifamycinanaloger använts för att behandla MRSA, andra grampositiva och gramnegativa infektioner och Mycobacterium spp.-infektioner5. På 1990-talet, för att effektivt behandla ett ökande antal M. tuberculosis-infektioner, kombinerades ytterligare läkemedel med rifamycinanaloger för att öka deras effektivitet. Cirka 5% av M. tuberkulosfall förblir dock resistenta motrifampicin5,6, och det finns en ökande oro för multiresistenta bakterier7. För närvarande kanske användningen av enbart antibiotika inte är tillräcklig vid behandling av vårdrelaterade infektioner, och detta har lett till ett pågående sökande efter alternativa antimikrobiella behandlingar1.
Tungmetaller, såsom silver (Ag)8,9,10 och guld (Au)11, och keramik, såsom titandioxid (TiO2)12 och zinkoxid (ZnO)13, i nanopartikelform (NP) (AgNP, AuNP, TiO2NPrespektive ZnONP) har undersökts för deras antimikrobiella aktiviteter och har identifierats som potentiella antibiotikaalternativ. Dessutom bioresorberbara material, såsom magnesiumlegeringar (Mg-legeringar)14,15,16, magnesiumoxidnanopartiklar 17,18,19,20,21 och magnesiumhydroxidnanopartiklar [nMgO respektive nMg(OH)2]22,23,24, har också undersökts. De tidigare antimikrobiella studierna av nanopartiklar använde dock inkonsekventa material och forskningsmetoder, vilket resulterade i data som är svåra eller omöjliga att jämföra och ibland är motsägelsefulla till sin natur18,19. Till exempel varierade den minsta hämmande koncentrationen (MIC) och minsta bakteriedödande koncentrationen (MBC) av silvernanopartiklar signifikant i olika studier. Ipe et al.25 utvärderade de antibakteriella aktiviteterna hos AgNP med en genomsnittlig partikelstorlek på ~ 26 nm för att bestämma MIC: erna mot grampositiva och gramnegativa bakterier. De identifierade MIC-värdena för P. aeruginosa, E. coli, S. aureus och MRSA var 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml respektive 10 μg/ml. Däremot utvärderade Parvekar et al.26 AgNP med en genomsnittlig partikelstorlek på 5 nm. I detta fall befanns AgNP MIC och en MBC på 0,625 mg / ml vara effektiva mot S. aureus. Dessutom utvärderade Loo et al.27 AgNPs med en storlek på 4,06 nm. När E. coli exponerades för dessa nanopartiklar rapporterades MIC och MBC vid 7,8 μg/ml. Slutligen undersökte Ali et al.28 de antibakteriella egenskaperna hos sfäriska AgNP med en genomsnittlig storlek på 18 nm. När P. aeruginosa, E. coli och MRSA exponerades för dessa nanopartiklar identifierades MIC vid 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml respektive 36 μg/ml, och MBC identifierades vid 36 μg/ml, 42 μg/ml respektive 30 μg/ml.
Även om nanopartiklarnas antibakteriella aktivitet har studerats och rapporterats i stor utsträckning under de senaste decennierna finns det ingen standard för de material och forskningsmetoder som används för att möjliggöra direkta jämförelser mellan studier. Av denna anledning presenterar vi två metoder, den direkta samodlingsmetoden (metod A) och den direkta exponeringsmetoden (metod B), för att karakterisera och jämföra nanopartiklarnas antimikrobiella aktiviteter samtidigt som material och metoder hålls konsekventa.
Förutom nanopartiklar har nanostrukturerade ytor också undersökts för antibakteriella aktiviteter. Dessa inkluderar kolbaserade material, såsom grafennanoark, kolnanorör och grafit29, såväl som rena Mg- och Mg-legeringar. Var och en av dessa material har uppvisat minst en antibakteriell mekanism, inklusive fysisk skada på cellmembran av kolbaserade material och skador på metaboliska processer eller DNA genom frisättning av reaktiva syreradikaler (ROS) när Mg bryts ned. Dessutom, när zink (Zn) och kalcium (Ca) kombineras vid bildandet av Mg-legeringar, förbättras förfiningen av Mg-matriskornstorleken, vilket leder till en minskning av bakteriell vidhäftning till substratytor jämfört med endast Mg-prover14. För att demonstrera antibakteriell aktivitet presenterar vi direktodlingsmetoden (metod C), som bestämmer bakteriell vidhäftning på och runt nanostrukturerade material över tid genom kvantifiering av bakteriella kolonibildande enheter (CFU) med direkt och indirekt ytkontakt.
Geometrin hos nanostrukturer på ytor, inklusive storlek, form och orientering, kan påverka materialens bakteriedödande aktiviteter. Till exempel tillverkade Lin et al.16 olika nanostrukturerade MgO-lager på ytorna av Mg-substrat genom anodisering och elektroforetisk deponering (EPD). Efter en period av exponering för den nanostrukturerade ytan in vitro minskade tillväxten av S. aureus avsevärt jämfört med obehandlad Mg. Detta indikerade en större styrka hos den nanostrukturerade ytan mot bakteriell vidhäftning jämfört med den obehandlade metalliska Mg-ytan. För att avslöja de olika mekanismerna för antibakteriella egenskaper hos olika nanostrukturerade ytor diskuteras i denna artikel en fokuserad kontaktexponeringsmetod (metod D) som bestämmer cell-yteinteraktionerna inom intresseområdet.
Syftet med denna artikel är att presentera fyra in vitro-metoder som är tillämpliga på olika nanopartiklar, nanostrukturerade ytor och mikrobiella arter. Vi diskuterar viktiga överväganden för varje metod för att producera konsekventa, reproducerbara data för jämförbarhet. Specifikt används den direkta samodlingsmetoden17 och den direkta exponeringsmetoden för att undersöka nanopartiklarnas antimikrobiella egenskaper. Genom den direkta samodlingsmetoden kan de minsta hämmande och minsta bakteriedödande koncentrationerna (MIC respektive MBC90-99,99) bestämmas för enskilda arter, och den mest potenta koncentrationen (MPC) kan bestämmas för flera arter. Genom den direkta exponeringsmetoden kan de bakteriostatiska eller bakteriedödande effekterna av nanopartiklar vid minimala hämmande koncentrationer karakteriseras av optiska densitetsavläsningar i realtid över tiden. Direktkultur14-metoden är lämplig för att undersöka bakterier direkt och indirekt i kontakt med nanostrukturerade ytor. Slutligen presenteras metoden med fokuserad kontaktexponering16 för att undersöka den antibakteriella aktiviteten hos ett specifikt område på en nanostrukturerad yta genom direkt applicering av bakterier och karakterisering av bakterietillväxt vid cell-nanostrukturgränssnittet. Denna metod är modifierad från den japanska industristandarden JIS Z 2801: 200016 och är avsedd att fokusera på mikrob-ytinteraktioner och utesluta effekterna av bulkprovnedbrytning i mikrobiell kultur på antimikrobiella aktiviteter.
Vi har presenterat fyra in vitro-metoder (A-D) för att karakterisera de antibakteriella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor. Medan var och en av dessa metoder kvantifierar bakterietillväxt och livskraft över tid som svar på nanomaterial, finns det en viss variation i de metoder som används för att mäta den initiala bakteriella sådddensiteten, tillväxten och livskraften över tiden. Tre av dessa metoder, den direkta samodlingsmetoden (A)17, direktodlingsmeto…
The authors have nothing to disclose.
Författarna uppskattar det ekonomiska stödet från US National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 och NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) och UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant som tilldelats Patricia Holt-Torres. Författarna uppskattar hjälpen från Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) vid UC-Riverside för användning av SEM / EDS och Dr. Perry Cheung för användning av XRD. Författarna vill också tacka Morgan Elizabeth Nator och Samhitha Tumkur för deras hjälp med experimenten och dataanalyserna. Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i denna artikel är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna från National Science Foundation eller National Institutes of Health.
1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
pH meter | VWR | SP70P | |
Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
Sonicator | VWR | 97043-936 | |
Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |