Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

Summary

Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.

Abstract

Le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate, come argento, ossido di zinco, biossido di titanio e ossido di magnesio, sono state esplorate in precedenza in contesti clinici e ambientali e in prodotti alimentari di consumo. Tuttavia, la mancanza di coerenza nei metodi sperimentali e nei materiali utilizzati è culminata in risultati contrastanti, anche tra studi sugli stessi tipi di nanostrutture e specie batteriche. Per i ricercatori che desiderano impiegare nanostrutture come additivo o rivestimento nella progettazione di un prodotto, questi dati contrastanti limitano il loro utilizzo in contesti clinici.

Per affrontare questo dilemma, in questo articolo, presentiamo quattro diversi metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate e discutiamo la loro applicabilità in diversi scenari. L’adattamento di metodi coerenti dovrebbe portare a dati riproducibili che possono essere confrontati tra gli studi e implementati per diversi tipi di nanostrutture e specie microbiche. Introduciamo due metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e due metodi per le attività antimicrobiche delle superfici nanostrutturate.

Per le nanoparticelle, il metodo della cocoltura diretta può essere utilizzato per determinare le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime di nanoparticelle e il metodo di coltura a esposizione diretta può essere utilizzato per valutare in tempo reale l’attività batteriostatica rispetto all’attività battericida derivante dall’esposizione alle nanoparticelle. Per le superfici nanostrutturate, il metodo della coltura diretta viene utilizzato per determinare la vitalità dei batteri indirettamente e direttamente a contatto con superfici nanostrutturate e il metodo di esposizione a contatto focalizzato viene utilizzato per esaminare l’attività antimicrobica su un’area specifica di una superficie nanostrutturata. Discutiamo le principali variabili sperimentali da considerare per la progettazione di studi in vitro quando si determinano le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate. Tutti questi metodi sono relativamente a basso costo, impiegano tecniche relativamente facili da padroneggiare e ripetibili per coerenza e sono applicabili a una vasta gamma di tipi di nanostrutture e specie microbiche.

Introduction

Solo negli Stati Uniti, 1,7 milioni di individui sviluppano un’infezione acquisita in ospedale (HAI) ogni anno, con una su 17 di queste infezioni con conseguente morte¹. Inoltre, si stima che i costi di trattamento per le IAA vadano da $ 28 miliardi a $ 45 miliardi all’anno ^1,2. Queste ICA sono predominate da Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA)^3,4 e Pseudomonas aeruginosa^4, che sono comunemente isolati dalle infezioni croniche della ferita e di solito richiedono un trattamento esteso e tempo per produrre un esito favorevole al paziente.

Negli ultimi decenni, sono state sviluppate più classi di antibiotici per trattare le infezioni legate a questi e ad altri batteri patogeni. Ad esempio, analoghi della rifamicina sono stati usati per trattare MRSA, altre infezioni gram-positive e gram-negative e infezioni da Mycobacterium spp.⁵. Nel 1990, per trattare efficacemente un numero crescente di infezioni da M. tuberculosis, ulteriori farmaci sono stati combinati con analoghi della rifamicina per aumentare la loro efficacia. Tuttavia, circa il 5% dei casi di M. tuberculosis rimane resistente allarifampicina ^5,6 e vi è una crescente preoccupazione per quanto riguarda i batteri multi-farmaco resistenti⁷. Attualmente, l’uso di antibiotici da solo potrebbe non essere sufficiente nel trattamento delle IAA e ciò ha provocato una continua ricerca di terapie antimicrobiche alternative¹.

I metalli pesanti, come l’argento (Ag)8,9,10 e l’oro (Au)11, e la ceramica, come il biossido di titanio (TiO 2)12 e l’ossido di zinco (ZnO)¹³, in forma di nanoparticelle (NP) (AgNP, AuNP, TiO ₂ NPe ZnONP, rispettivamente) sono stati esaminati per le loro attività antimicrobiche e sono stati identificati come potenziali alternative antibiotiche. Inoltre, materiali bioriassorbibili, come leghe di magnesio (leghe di Mg)14,15,16, nanoparticelle di ossido di magnesio 17,18,19,20,21 e nanoparticelle di idrossido di magnesio [nMgO e nMg(OH)₂, rispettivamente]^22,23,24, sono stati esaminati anche. Tuttavia, i precedenti studi antimicrobici sulle nanoparticelle hanno utilizzato materiali e metodi di ricerca incoerenti, ottenendo dati difficili o impossibili da confrontare e talvolta contraddittori in natura^18,19. Ad esempio, la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC) di nanoparticelle d’argento variavano significativamente in diversi studi. Ipe et al.25 hanno valutato le attività antibatteriche degli AgNP con una dimensione media delle particelle di ~ ²⁶ nm per determinare le MIC contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Le MIC identificate per P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA erano rispettivamente 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL. Al contrario, Parvekar et ^al.26 hanno valutato AgNP con una dimensione media delle particelle di 5 nm. In questo caso, l’AgNP MIC e un MBC di 0,625 mg/ml sono risultati efficaci contro S. aureus. Inoltre, Loo et ^al.27 hanno valutato AgNP con una dimensione di 4,06 nm. Quando E. coli è stato esposto a queste nanoparticelle, il MIC e l’MBC sono stati riportati a 7,8 μg / ml. Infine, Ali et ^al.28 hanno studiato le proprietà antibatteriche degli AgNP sferici con una dimensione media di 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA sono stati esposti a queste nanoparticelle, il MIC è stato identificato a 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL e 36 μg / mL, rispettivamente, e l’MBC è stato identificato a 36 μg / mL, 42 μg / mL e 30 μg / mL, rispettivamente.

Sebbene l’attività antibatterica delle nanoparticelle sia stata ampiamente studiata e riportata negli ultimi decenni, non esiste uno standard per i materiali e i metodi di ricerca utilizzati per consentire confronti diretti tra gli studi. Per questo motivo, presentiamo due metodi, il metodo di co-coltura diretta (metodo A) e il metodo di esposizione diretta (metodo B), per caratterizzare e confrontare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle mantenendo i materiali e i metodi coerenti.

Oltre alle nanoparticelle, sono state esaminate anche superfici nanostrutturate per attività antibatteriche. Questi includono materiali a base di carbonio, come nanofogli di grafene, nanotubi di carbonio e grafite²⁹, nonché leghe pure di Mg e Mg. Ognuno di questi materiali ha mostrato almeno un meccanismo antibatterico, tra cui danni fisici imposti alle membrane cellulari da materiali a base di carbonio e danni ai processi metabolici o al DNA attraverso il rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS) quando il Mg si degrada. Inoltre, quando lo zinco (Zn) e il calcio (Ca) sono combinati nella formazione di leghe di Mg, viene migliorata la raffinatezza della granulometria della matrice di Mg, il che porta ad una riduzione dell’adesione batterica alle superfici del substrato rispetto ai campioni di solo Mg¹⁴. Per dimostrare l’attività antibatterica, presentiamo il metodo della coltura diretta (metodo C), che determina l’adesione batterica su e intorno a materiali nanostrutturati nel tempo attraverso la quantificazione di unità formanti colonie batteriche (CFU) con contatto superficiale diretto e indiretto.

La geometria delle nanostrutture sulle superfici, comprese le dimensioni, la forma e l’orientamento, potrebbe influenzare le attività battericide dei materiali. Ad esempio, Lin et ^al.16 hanno fabbricato diversi strati nanostrutturati di MgO sulle superfici dei substrati di Mg attraverso l’anodizzazione e la deposizione elettroforetica (EPD). Dopo un periodo di esposizione alla superficie nanostrutturata in vitro, la crescita di S. aureus è risultata sostanzialmente ridotta rispetto al Mg non trattato. Ciò ha indicato una maggiore potenza della superficie nanostrutturata contro l’adesione batterica rispetto alla superficie metallica Mg non trattata. Per rivelare i diversi meccanismi delle proprietà antibatteriche di varie superfici nanostrutturate, in questo articolo viene discusso un metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D) che determina le interazioni cellula-superficie all’interno dell’area di interesse.

L’obiettivo di questo articolo è presentare quattro metodi in vitro applicabili a diverse nanoparticelle, superfici nanostrutturate e specie microbiche. Discutiamo le considerazioni chiave per ciascun metodo per produrre dati coerenti e riproducibili per la comparabilità. In particolare, il metodo di cocoltura diretta¹⁷ e il metodo dell’esposizione diretta sono utilizzati per esaminare le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle. Attraverso il metodo della co-coltura diretta, le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC_90-99,99, rispettivamente) possono essere determinate per le singole specie e la concentrazione più potente (MPC) può essere determinata per più specie. Attraverso il metodo dell’esposizione diretta, gli effetti batteriostatici o battericidi delle nanoparticelle a concentrazioni minime inibitorie possono essere caratterizzati da letture della densità ottica in tempo reale nel tempo. Il metodo della coltura diretta¹⁴ è adatto per esaminare i batteri direttamente e indirettamente a contatto con superfici nanostrutturate. Infine, viene presentato il metodo dell’esposizione a contatto focalizzato¹⁶ per esaminare l’attività antibatterica di un’area specifica su una superficie nanostrutturata attraverso l’applicazione diretta di batteri e la caratterizzazione della crescita batterica all’interfaccia cellula-nanostruttura. Questo metodo è modificato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:2000¹⁶ e ha lo scopo di concentrarsi sulle interazioni microbo-superficie ed escludere gli effetti della degradazione del campione di massa in coltura microbica sulle attività antimicrobiche.

Protocol

Per presentare i metodi di co-coltura diretta e di esposizione diretta, utilizziamo nanoparticelle di ossido di magnesio (nMgO) come materiale modello per dimostrare le interazioni batteriche. Per presentare la coltura diretta e i metodi di esposizione a contatto focalizzato, utilizziamo una lega Mg con superfici nanostrutturate come esempi. 1. Sterilizzazione dei nanomateriali NOTA: Tutti i nanomateriali devono essere sterilizzati o disinfettati prim…

Representative Results

L’identificazione dell’attività antibatterica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e delle superfici nanostrutturate è stata presentata utilizzando quattro metodi in vitro applicabili a diversi tipi di materiali e specie microbiche. Il metodo A e il metodo B esaminano le attività batteriche quando esposte a nanoparticelle in una fase di ritardo (metodo A) e in una fase logaritmica (metodo B) per una durata pari o superiore a 24 ore. Il metodo A fornisce risultati per quanto r…

Discussion

Abbiamo presentato quattro metodi in vitro (A-D) per caratterizzare le attività antibatteriche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate. Mentre ciascuno di questi metodi quantifica la crescita batterica e la vitalità nel tempo in risposta ai nanomateriali, esistono alcune variazioni nei metodi utilizzati per misurare la densità iniziale di semina batterica, la crescita e la vitalità nel tempo. Tre di questi metodi, il metodo della cocoltura diretta (A)¹⁷, il metodo della coltura …

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2