Summary
Denne protokollen beskriver oppsett og kjøring av et mikrorespirometrisystem som kan brukes til å undersøke de fysiologiske egenskapene til korallholobiont.
Abstract
Metabolsk aktivitet, definert som summen av organismeprosesser som involverer energi, er av avgjørende betydning for å forstå funksjonen og utviklingen av livet på jorden. Måling av organismers metabolske hastigheter er derfor i sentrum for å forklare de fysiologiske tilstandene til organismer, deres økologiske roller og virkningen av miljøendringer på arter innenfor terrestriske og akvatiske økosystemer. På korallrev har målinger av metabolisme blitt brukt til å kvantifisere symbiosefunksjon mellom koraller og deres obligatoriske algesymbionter (Symbiodiniaceae), samt vurdere hvordan miljøstressorer, inkludert klimaendringer, vil påvirke korallhelsen. Til tross for denne betydningen er det mangel på metoder, og derfor data, knyttet til metabolske hastighetsmålinger i korallavkom, sannsynligvis på grunn av deres lille størrelse. For å løse dette gapet, hadde denne studien som mål å utvikle et tilpasset oppsett for å måle respirasjonen av små (millimeter størrelsesområde) marine dyr økologier. Dette lave kostnadene og enkle oppsettet skal tillate forbedret måling av metabolsk hastighet. Dette vil være avgjørende for anvendt økologisk forskning som benytter seksuell produksjon av koraller for revrestaurering.
Introduction
Respirasjon er en kritisk biologisk måling som signaliserer den generelle metabolske aktiviteten til en organisme, men som andre kritiske egenskaper (vekst), er vanskelig å måle i små organismer1. Respirasjon kan defineres som oksidasjon av organiske molekyler ved bruk av oksygen. Denne prosessen genererer den kjemiske energien som trengs for cellulær funksjon (dvs. metabolisme), noe som er avgjørende for organismers overlevelse. Alternativt gir anaerob metabolisme oksygengjeld2. Respirasjonshastigheter kan bestemmes ved hjelp av optoder som måler bruken (og dermed reduksjonen) av oksygenkonsentrasjon over tid i et lukket kammer, en praksis kjent som respirometri3. Gitt at flertallet av organismer ikke lagrer oksygen, kan metabolismen utledes gjennom direkte sammenheng mellom respirasjon og karbonbruk. På grunn av dette kan respirasjonshastighetene konverteres til daglig karbonbruk, noe som informerer kritiske metabolske funksjoner som vekst, reproduksjon og evnen til å opprettholde metabolsk homeostase i tider med miljøstress 4,5, inkludert varmebølgeforhold som generelt fører til stress eller bleking i koraller.
Korallrev faller globalt i en akselererende hastighet. Koralldyret huser et konsortium av partnere (inkludert dinoflagellate Symbiodiniaceae, sopp, bakterier og virus), samlet referert til som "holobiont"6. Når havtemperaturen stiger, er koraller, og derfor korallrev, under økende press for å overleve, da høye temperaturer fører til tap av dinoflagellatet Symbiodiniaceae (heretter symbionter), et fenomen kjent som bleking7. Mange næringsstoffer er ellers utilgjengelige for koraller i oligotrofe tropiske farvann, inkludert uorganisk nitrogen og fosfor8. For å klare seg danner koraller en obligatorisk ernæringssymbiose med sine dinoflagellatsymbionter (Symbiodiniaceae), som gir flertallet av næringsstoffene som korallverten trenger for å overleve og deponere kalsiumkarbonatskjelettene9. En fungerende symbiose kan være preget av høy grad av karbondeling mellom partnere10,11, og reguleringen av symbiose innebærer en dynamisk homeostase12.
Under varmestress forstyrres denne dynamiske reguleringen og kommunikasjonen, noe som resulterer i dysbiose og bleking (gjennomgått i referanse13). Metabolske målinger, som fotosyntese og respirasjon, har derfor potensial til å belyse både de sunne og uregulerte, dysbiotiske tilstandene til koraller, og nøyaktig måling av disse prosessene over ontogeni er avgjørende for å forstå organismefunksjon. Dette er spesielt viktig ettersom frekvensen og størrelsen på masseblekingshendelser øker, med potensial til å påvirke endringer i næringsdeling fra symbionter, hvor karbonoverføring har vist seg å avta etter hvert som temperaturen øker14. Dette kan skyldes rettede mekanismer av symbiontbindende næringsstoffer eller fra hardfysiologiske avveininger (økt termisk toleranse, men en reduksjon i vertsoverlevelse 15,16,17). Forstyrrelser i symbiose kan stamme fra både symbionten og verten, selv om en ledende faktor sannsynligvis er den cellulære funksjonsfeilen til symbionten18. Imidlertid destabiliserer stress forårsaket av økning i sjøvannstemperaturer denne symbiosen; Karbondeling fra symbiont til vert er redusert19,20, og sult av korallene kan følge. Dette kan gjenspeiles i reduserte lipid- og karbohydratlagre i koraller på grunn av økt vertsbruk ("økt katabolisme av fast karbon"), sannsynligvis på grunn av redusert deling av symbionter11. Ved siden av bidraget fra fotosyntese og respirasjon fra korallenes symbionter, er respirasjon av koralldyret et viktig tiltak for å forstå korallhelse, virkningene av bleking og næringsutveksling mellom disse partnerne, og veksten av holobiont, en fenotype relevant for å overleve miljøendringer 8,21,22. Til slutt, gitt at mange koraller er symbiotiske, er bruk av respirometri for å karakterisere fotosyntese i tillegg til respirasjon spesielt nyttig for kontekstualisering av P: R-forhold og forståelse av om symbiosen er stabil eller ikke (f.eks. referanse23).
Miljøendringer forårsaker derfor skift i energibudsjettene til korallen og dens symbionter, noe som fører til forskjeller i vekst14. For å takle, kan korallverten øke respirasjonen og lipidbruken for å møte dens metabolske krav; Varmespenning kan redusere nettoproduktiviteten med 60 % på grunn av denne økte respirasjonen14, målt ved en endring i oppløst oksygen. Symbiodiniaceae kan også øke nitrogenassimilering og karbonretensjon14,24, og deretter bruke disse reservene til å skifte energi mot sine egne reparasjons- og beskyttelsesmekanismer25,26. Balansen mellom N og C er viktig for å regulere veksten, og spesielt P27, som kan manifestere seg som en dynamisk regulering av symbiontmengde. Faktisk tyder bevis samlet fra koraller over store revutvidelser (>1,000 km) at verter har kapasitet til å begrense symbiontvekst gjennom regulering av P, selv om dette varierer etter korallarter27.
Samlet sett antyder disse studiene en gevinst av varmetoleranse med en samtidig reduksjon i enten produksjon eller translokasjon av næringsstoffer (dvs. tilbøyelighet til symbiose) på grunn av miljøendringer. Kraftige enkeltjuvenile metoder, som å kvantifisere oksygenbruk via mikrorespirometri, bør derfor brukes til å forstå de grunnleggende mekanismene knyttet til metabolisme og deretter brukes på bevaringsspørsmål som forståelse av varmetoleranseoppkjøp. Dette presenteres her som et mikrorespirometriverktøy for fysiologiske tiltak, beregnet på å undersøke ernæringsforholdet mellom korallyngel og deres algesymbionter, men egnet for andre små marine organismer.
Organismers bruk eller produksjon av oksygen kan måles ved å plassere dem i individuelle, hermetisk forseglede respirometrikamre eller "respirometre" (heretter kamre), hvor oksygenforandring måles ved hjelp av optoder3. Optoder er prober som måler oksygenkonsentrasjon ved hjelp av lyspulser, og logging av målinger over tid gjør det mulig å beregne respirasjons- og/eller fotosyntesehastigheter. I praksis er måling av respirasjon lik måling av fotosyntese hos koraller, bortsett fra at korallene ruges i totalt mørke. Å trekke den totale daglige respirasjonen til koraller og symbionter fra den totale daglige fotosyntesen resulterer i en oksygendifferensial (oksygen delta)2,3. Vanligvis bruker organismer mer oksygen enn de produserer, noe som resulterer i et underskudd. Dette kan konverteres til karbonekvivalenter siden oksygen og karbon forbrukes i et fast forhold2. Karbonoverskuddet kan brukes av korallene til vekst, slimsyntese og reproduksjon, og andre viktige metabolske behov12.
Denne protokollen beskriver en mikrorespirasjonsmetode (figur 1) som ble brukt til å måle respirasjonshastigheter (R) for individuelle korallungdommer ved bruk av en skreddersydd 1,5 ml glasskammerdesign (hetteglass med GL25-gjenge og 20 mm høy, med støt/møne, flatmarksfelg og skrukork med hull; se materialfortegnelse) fylt med 0,5 μm filtrert sjøvann. Fiberoptoder (se materialfortegnelse) ble satt inn i hvert kammer gjennom et hull i siden av lokket. Hver enkelt korall ble festet over en hardmasket, gjennomstrømningsplateplattform over en magnetisk rørestang for å sikre tilstrekkelig blanding av vann i kammeret. I det representative eksemplet her ble to kontroller eller "blanke" (kamre som var identiske bortsett fra tilstedeværelsen av prøven) målt samtidig med de tre replikerende prøvekamrene, da vi hadde flere kontrollere som kjørte samtidig. Oppsetteksemplet (figur 2) viser imidlertid bare bruken av fire kanaler; Dette kan økes ved hjelp av flere kontrollere og flere gjennomstrømningsstativer. Temperaturen kan også styres i dette systemet ved å senke hvert kammer i et skreddersydd vannbad med forhåndsinnstilte vanntemperaturer (27 °C for styring eller 31 °C for høytemperaturspenningen i eksempeldataene her) ved hjelp av et resirkulerende gjennomstrømningssystem (kontinuerlig, skånsom strømning satt til 75 l/t). Omrørerplateplattformen og omrørerplaten med tannhjul kan være i hvilken som helst størrelse og kan gjøres så stor eller så liten som nødvendig for å imøtekomme antall glasskamre. I dette eksemplet var plattformen og platen ca. 34 cm x 26 cm x 3 cm (materialfortegnelse). Kalibrering av optodene ble utført før hver kjøring ved hjelp av to standardløsninger som representerer 0 % og 100 % oksygenmetning ved riktig vanntemperatur og saltholdighet for denne eksperimentelle innstillingen.
Protocol
1. Oppsett av utstyr og koraller i respirasjonskamrene
MERK: Reproduktivt klare koraller (dvs. de som hadde rosa pigmenterte egg / sædbunter synlige fra fragmenterte grener fra arten Acropora tenuis kolonier) ble løsnet fra revet på Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'Ø) på dagen for fullmåne i oktober 2018 (tillatelsesnummer: G12/35236.1), samlet inn og brakt inn i laboratoriet for korallgyting, hvor unge koraller ble avlet og dyrket.
- På måledagen kobler du de to vannbadplatene ved hjelp av blå polypipe og kontakter (se Materialfortegnelse; Figur 1 [5], figur 2A,B). Disse vil fungere som inkubatorer etter tilkobling med den blå polypipen til varmtvannsberederen/kjøleren. Sørg for at motorplaten tydelig kan sees gjennom de gjennomsiktige vannbadplatene når respirometrikamrene ikke er på plass.
- Koble de to slangene til varmtvannsberederen/kjøleren (se Materialfortegnelse). Slå på varmtvannsberederen/kjøleren, og still deretter inn ønsket eksperimentell temperatur (27 °C eller 31 °C).
- Koble bunnen av vannbadet (trinn 1.1) til basemotorplaten med magnetgirene (figur 1 [6, 7] og figur 3A), og koble deretter denne enheten til en strømkilde (figur 3B). Slå på strømkilden for å aktivere girene, som vil aktivere omrørerstengene i kamrene.
- Moduler vannstrømmen etter behov (f.eks. kontinuerlig, mild strømning satt til 75 l/t med langsom omrøring ved 30 o / min) ved hjelp av ventilkoblingsknappene (figur 3C).
- For å montere respirometrikammeret, tilsett magnetdråpen (figur 1 [1.5]) til glasskammeret (figur 1 [1.6]), og deretter den ugjennomsiktige plaststrømningsstativbasen (figur 1 [1.4]) inn i glasskammeret (figur 4A). Størrelsen på kammeret og den magnetiske perlen vil avhenge av organismen og studiesystemet av interesse.
MERK: Det er hull i plastbasen for å tillate vannstrøm og sirkulasjon fra bevegelsen av magnetperlen i bunnen. - Lim korallen ved hjelp av akvariumlim (se materialfortegnelse) til den svarte glidelåsen som er plassert i plastbunnen (figur 4B-D). For å gjøre dette, lim først korallungdommen til et stykke svart plast, og lim deretter dette stykket til plastbasen. Når korallen er festet sikkert (herding av limet er nesten øyeblikkelig), skru lokket med O-ringen (figur 4A) på glasskammeret. Utfør disse handlingene under vann i et separat basseng for å sikre at det ikke er luft i respirometrikammeret.
MERK: Vannvolumet i respirometeret (dvs. effektivt volum = 1,5 ml) ble bestemt gjennom fullstendig nedsenking av kammeret under vann. Antagelsen er at i forhold til vannvolumet er forskyvningen fra massen/tettheten til den svært lille korallen ubetydelig. 1,5 ml mikrosentrifugerøret er vist her for skala (figur 4A). - Sett kamrene godt inn i vannbadene (figur 5A). Sørg for at glasskamrene er i kontakt med det temperaturkontrollerte vannet for forsøket.
- Koble O2 fiberoptiske kabler (se Materialfortegnelse) slik at de er i kontakt med oksygensensorpunktene (heretter kalt flekker; se Materialfortegnelse) ved å sette dem inn i hullet som er boret inn i siden av lokkkamrene. Disse små flekkene er oksygenfølsomme og vil oppdage og overføre signalet fra kammeret gjennom den fiberoptiske kabelen.
- Legg til rørleggertape (hvit, tynn, selvforseglende tape) for å få kabelen til å passe godt og for å la den forbli godt inne i vannkammeret. Sørg for at de enkelte korallene kan sees (som vist i figur 5B), med brune tentakler vendt opp, inne i kammeret (figur 5B, video 1).
MERK: Kostnadsestimater for komponentene i apparatet er gitt i tabell 1.
- Legg til rørleggertape (hvit, tynn, selvforseglende tape) for å få kabelen til å passe godt og for å la den forbli godt inne i vannkammeret. Sørg for at de enkelte korallene kan sees (som vist i figur 5B), med brune tentakler vendt opp, inne i kammeret (figur 5B, video 1).
2. Standard driftsprosedyre for måling av respirasjon ved bruk av O2-systemet
- Åpne programvaren for oksygenmåling (se Materialfortegnelse).
- Mål temperaturen i rommet der kalibreringen skal utføres. Dette vil være nødvendig senere for kalibreringstrinnet (trinn 2.8).
- Monter optiske sensorer og deksler. For å gjøre dette, koble all fiberoptikk til den matchende porten i O2-modulen . Sørg for å matche cap 1 med sensor 1, cap 2 med sensor 2, og så videre.
- For å sette opp kamrene for kalibrering, fukt først et stykke ren svamp med litt omvendt osmose (RO) vann og sett det inn i hvert kammer.
NOTAT: Svampen skal ikke dryppe, bare være fuktig. Det kan dryppe på det fiberoptiske stedet. Forsikre deg om at stedet ikke er vått før du går videre til neste trinn. - Plasser kamrene opp ned med matchende fiberoptikk (figur 6). Dette vil tillate å skru av kammeret uten å berøre fiberoptikken og tilsette natriumsulfitten for 0% kalibrering.
- Kontroller signalet til hver sensor før kalibreringen starter. Gå gjennom alle fanene i programvaregrensesnittet og kontroller signalverdien (øverst til venstre) (figur 7A), slik at de ikke varierer vesentlig. Sjekk O2-håndboken for de akseptable verdiene for eksperimentelt oppsett (avhengig av organismen og forholdene av interesse). For dette spesifikke oppsettet, ved en romtemperatur på 25,3 °C, er en FTC (oksygensensorpunktstrøm gjennom cellens normale område) på 20,59 med signalet ved 179,5 akseptabelt.
- Åpne programmet og kontroller innstillingene i programvaren for å bekrefte at de er riktige som beskrevet nedenfor. Hvis popup-vinduet ikke vises umiddelbart etter at programmet er åpnet, kan dette gjøres ved å klikke på Innstillinger-knappen nederst til venstre i programvaregrensesnittet.
- Kontroller at den eksterne temperatursensoren er aktivert (figur 7B). Endre innstillingen til Fast temperatur (figur 7C). Deretter legger du til romtemperaturverdien og klikker på kopiinnstilling til alle andre kanaler.
- Endre innstillingen til Reduser signaldrift (figur 7C). Velg deretter Sensorinnstillinger og velg nivå 2. Ellers, hvis du bruker små volumer, vil driften være så høy at det vil være vanskelig å kalibrere.
- Kontroller de generelle innstillingene for kanalene. Trykk Ok hvis det er aktuelt. Klikk kopier innstillinger til alle kanalene, og klikk deretter ok.
- Kalibrer sensorene. For kanal 1-kalibrering, gå til kategorien Kanal 1 og trykk på Kalibrer-knappen . Velg 2-punkts i vann eller fuktig luft.
- For "luft" -kalibreringen, dypp et stykke skum i vann, plasser det inne i kammeret og vent til signalet stabiliserer seg (se før og etter luftkalibreringsbilder). Når du er stabil, trykk "sett luft". Klikk luft > Kalibrer > sett luft.
- Still inn kalibreringene 0 % og 100 % (figur 7D). Fjern kammeret fra hetten og plasser det i neste hette slik at luftkalibreringssignalet er klart når 0 %-kalibreringen i den første sensoren er ferdig. Bruk en overføringspipette og fyll lokket med 2 % natriumsulfitt. Vent til signalet stabiliserer seg.
MERK: Signalet tar vanligvis mer tid å stabilisere sammenlignet med luftkalibreringen. Hvis det vises en advarsel som sier at "verdiene er utenfor typisk område", må du kontrollere at natriumsulfitten er frisk. Gjenta den samme kalibreringsprosessen for alle kanalene. Forbered natriumsulfitten ved å tilsette 2 g i 100 ml RO-vann. - Når kalibreringen er fullført, skyll åndedrettskamrene godt og tørk kamrene og lokkene. Pass på at det ikke er vann i det fiberoptiske hullet.
- Plasser organismen (enkelte korallungdommer, i dette eksemplet) inne i respirasjonskamrene og lukk med lokk. Når du legger lokkene, må du sørge for å gjøre det når kamrene er helt nedsenket og det er absolutt ingen luft inni.
- Plasser kamrene godt i omrøringsplaten og koble fiberoptikken.
- Slå på strømforsyningen. Pass på at vannet inne i kamrene blandes helt. Still inn temperaturen i kjøleren/varmeren på de valgte eksperimentelle temperaturene.
- Slå på pumpen og varmeren (trinn 1.2 og 1.4).
- Trykk på logg på O2 måleprogramvaregrensesnittet for å starte opptaket.
Representative Results
Databehandling og analyse
Selv om det finnes mange metoder for å behandle rådata fra respirometriforsøk, anbefales det å bruke R-pakken respR28. I tråd med delingen av protokollene ovenfor, som taler for åpen vitenskap og reproduserbarhet, gjør denne pakken det mulig å dele databehandling og analyse i en lett reproduserbar form og er designet med det i tankene. Det er en gratis, åpen kildekode-plattform og sondesystemagnostiker, og kan enkelt installeres enten fra CRAN eller GitHub. Full kode og eksempler for respR vedlikeholdes og finnes på https://github.com/januarharianto/respR.
RespR-pakken har funksjoner for å importere, visualisere og utføre kvalitetskontroll på respirometridata, og for å beregne respirasjonshastigheter enten automatisk eller fra manuelt valgte regioner. Det kan også justere frekvenser for bakgrunnsrespirasjon og konverteringsfrekvenser til ofte brukte utgangsenheter. Trinnene for å behandle dataene fra mikrorespirometrisystemet er beskrevet nedenfor. I denne studien ble dataene fra respirometrisystemet brukt som et eksempel, men pakken godtar også innganger fra de fleste kommersielt tilgjengelige oksygenprobesystemer samt generiske R-dataobjekter. Flere detaljer om pakken, inkludert fullstendig dokumentasjon og opplæringsprogrammer, finner du på pakkens nettside på https://januarharianto.github.io/respR/index.html.
Importere rådata
Den rå utdatafilen (.txt) importeres. respR gjenkjenner formatet og analyserer det til en generisk R-dataramme som kan brukes i etterfølgende funksjoner. Det er imidlertid viktig å merke seg at dette er valgfritt; disse filene og praktisk talt alle oksygen tidsseriedata kan også importeres ved hjelp av basefunksjoner (gitt nedenfor) av alle med grunnleggende kunnskap om R.
#load respR
Bibliotek(respR)
#Import ---
Data <- import_file("file.txt")
#Firesting-Pryo-fil oppdaget
Inspeksjon og visualisering av dataene
En viktig del av enhver dataanalyseoppgave er å plotte og inspisere dataene for å se etter åpenbare uregelmessigheter eller mønstre, eller til og med bare å bidra til å forstå det. Inspeksjonsfunksjonen brukes her (figur 8A), som kontrollerer for problemer som er felles for respirometridata, for eksempel ikke-numeriske eller manglende verdier.
#inspect en enkelt oksygenkolonne
Insp <-inspect(data, tid = 3, oksygen = 8, bredde = 0,2)
Denne funksjonen plotter også oksygentidsserien og beregner en rullehastighet (nederste panel) for å bidra til å belyse hvordan denne hastigheten kan endres i løpet av eksperimentet. Disse rullerende hastighetsplottene bidrar til å informere om hvilke regioner av disse hastighetskurvene som skal trekkes ut. Når det gjelder standard eller rutinemessige metabolske hastigheter, er de ønskede regionene de der hastigheten viser stabilitet (f.eks. etter rundt 3000 tidspunkter; Figur 8B).
Her blir synkende oksygen først detekterbart etter rundt rad 200 i hele tidsseriepanelet. Mønstre som dette er svært vanlige i respirometridata; Det er ofte en lengre periode med ustabilitet ved starten av et eksperiment ettersom systemet stabiliserer seg og prøven blir akklimatisert til de eksperimentelle forholdene. Det anbefales at rater bare trekkes ut fra tidsseriene etter denne innledende ustabiliteten, noe som også fremhever viktigheten av visualiseringer.
Utdrag priser
respR har to funksjoner for å trekke ut respirasjonshastigheter. Den første er calc_rate()-funksjonen, som gjør det mulig å trekke ut en hastighet manuelt ved å angi et område med tid, rad eller oksygennivå. Dette er svært vanlig i respirometrianalyser, og en helt akseptabel metode for å bestemme en rate så lenge seleksjonskriterier besluttes og anvendes konsekvent28.
En mer robust og objektiv måte er å bruke auto_rate() -funksjonen, som identifiserer lineære områder av dataene. Disse regionene er de med konsekvent vedvarende respirasjonsfrekvenser, tildelt automatisk ved hjelp av maskinlæring. Denne funksjonen er også nyttig for påvisning av lave signaler (som i prøvene som ble brukt i denne aktuelle studien, på grunn av den lave biomassen i denne alderen). Denne funksjonen gjør det mulig å identifisere de mest lineære, minimums- og maksimumshastighetene ved hjelp av uavhengige, objektive og statistisk robuste metoder28. Eksemplet her identifiserer et lineært område som forekommer fra rundt tidspunkter 3000 til 5000. Det skal bemerkes at flere lineære regioner kan identifiseres, men denne delen er den høyest rangerte, eller mest lineære, regionen (figur 8C).
#Determine mest lineære (dvs. konsistente) hastigheten
Rente <-auto_rate(insp)
Justering av bakgrunn
Bakgrunnsrater fra kontrolleksperimenter kan bestemmes på samme måte som eksemplet ovenfor, og kan brukes til å justere prøvefrekvensene ved hjelp av adjust_rate() -funksjonen (figur 9A; merk at hele analysen ikke vises her, bare justeringen). Fullstendige eksempler er detaljert på respR-nettstedet .
#Adjust sats for bakgrunn
rate_adj <-adjust_rate(rate, by = bg) #saved bg-objekt
utskrift(rate_adj)
Konvertere priser
Det siste trinnet er å konvertere hastighetene til de ønskede utgangsenhetene, ved å bruke de opprinnelige enhetene i rådataene, effektivt volum av respirometeret og andre eksperimentelle data, inkludert normalisering til tomme målinger (figur 9B). Utgangen kan være en absolutt respirasjonshastighet, det vil si av hele prøven, eller en masse- eller overflatespesifikk hastighet. Den overflatespesifikke hastigheten var utgangen som ble brukt her, som spesifikt er den absolutte hastigheten dividert med prøvens overflateareal (figur 9C).
Som diskutert ovenfor ble dette systemet utviklet for å måle svært små prøver. Derfor forventet vi lave verdier og potensiell overlapp med blanke målinger. Et visst signalnivå forventes innenfor emnene, og når de undersøkes, er disse verdiene innenfor det forventede området for generell eksperimentell støy, muligens på grunn av sondedrift, små temperaturendringer eller bobler på sondene. Ved design og på grunn av den lille prøvestørrelsen, og derfor lite effektivt volum som brukes, er bruken av emner spesielt viktig her, spesielt for hver kjøring. Representative verdier er her tatt med som eksempel (figur 10). Gitt den lille prøvestørrelsen, anbefaler vi bruk av emnene ved hver kjøring for å standardisere målinger per kjøring.
Disse tomme verdiene brukes deretter til å standardisere behandlingsmålingsverdier. Gitt koraller respirerer i tillegg til å produsere oksygen, kan metabolismen variere fra negative til positive verdier. Et eksempel på representative resultater av rekkevidden av respirasjonsverdier oppdaget fra mikrorespirasjonsverktøyet er gitt her. Disse resultatene ble bestemt fra et vellykket eksperiment på enkeltkorallungdommer (figur 10). Samlet sett var respirasjon forventet å være vanskelig å oppdage i dette eksempeldatasettet (ved design), gitt den lille størrelsen på prøvene; Dette understreker verdien av denne metoden for å fange opp denne lave signalterskelen. Disse representative resultatene viser respirasjon i mørket ved de minste prøvestørrelsene som er testet, noe som understreker minimumsdeteksjonsterskelen for dette systemet. Vi målte også under to forhold (kontroll og høy temperatur stress). Etter standardisering til emnene målt per kjøring, varierte verdiene fra nær null (kontroll) til en median på ~-5e-5 for stressbehandlingen. Som forventet var respirasjonen lav. Disse resultatene viser tydelig representative verdier for emner, samt en kontroll versus høy temperatursammenligning for disse svært små prøvene.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av det nye mikrorespirometriverktøyet for fysiologisk karakterisering av korallholobiont (koralldyr + symbionter) eller en hvilken som helst liten organisme (<1 mm). Tilpassede respirometrikamre ble laget (nummer 1; 1,1-1,6). Disse inkluderer lokk (1.1) med oksygensensorpunkter (1.2), og den enkelte ungdommen (1.3) er plassert på et gjennomstrømningsstativ (1.4) satt på toppen av en magnetomrører (1.5), som alle passer inn i glasskammeret (1.6). Kontrolleren (2) er festet til stedet med en fiberoptisk kabel som passer inn i lokket (1) og kobles til datamaskinen (3). Varmeapparatet/kjøleren (4) kobles til respirometriplaten (5) med gjennomstrømningsvannet (indikert med vinkelpiler for retning), som sitter på toppen av omrørerplaten (6) med gir (7), drevet av motoren (8) og strømforsyningen (9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av mikrorespirometri. Flere alternativer er tilgjengelige, inkludert (A) en respirometriplate eller (B) koblet til flere plater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spesialbygd magnetisk omrørerplate på toppen av respirometriplaten. Hvert kammer har (A) et magnetisk omrørergir under, (B) drevet av en motor, med (C) respirometriplaten forbundet med slanger til varmeren/kjøleren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tilpasset respirometrikammeroppsett. (A) Komponenter (fra venstre mot høyre: lokk, hetteglass, stativ, 1,5 ml rør for skala og omrørestang). (B) Individuelt gjennomstrømningsstativ som prøven sitter innenfor. (C) Ovenfra-og-ned-visning av gjennomstrømningsstativet. (D) og med stativet plassert inne i hetteglasset med lokket skrudd på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hetteglass av glass plassert i omrørerplaten. (A) Spesialbygd omrørerplate med (B) et nærbilde av hele hetteglasset med lokket. Den unge korallen kan sees gjennom lokket her (brun prikk), på toppen av glidelåsen, med fiberoptikken plassert i lokkåpningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kamre plassert opp ned, klare for kalibrering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Viktige trinn i programvaren for oksygenmåling. (A) Kontroller signalet til hver sensor. Et optimalt signal for denne studien og sensorer vises i oksygensensorpunktet FTC (normalområde). (B) Kontroller signaldriften. (C) Still inn og kontroller behandlingstemperaturene. (D) Still inn og kontroller 0 % og 100 % kalibreringene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: respR-analyseutgangstrinn I. (A) Inspiser kommandoen og utdataene. (B) Kontroller hastighetsstabiliteten. (C) Bestem den mest lineære hastigheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: respR-analyse utgangstrinn II. (A) Juster hastigheten for bakgrunn, (B) Konverter og (C) sjekk prisene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Representative resultater fra mikrorespirometriverktøyet. Median respirasjon (O2 ± standardfeil) av replikere individuelle korallungdommer, inkludert blanke verdier samt respirasjon av individer under kontroll og høytemperaturspenningsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Ovenfra-og-ned-visning av respirometrikammeret med den unge korallen inne under en måleøkt. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tabell 1: Kostnadsestimater for komponenter i respirometriapparatet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Dette arbeidet skisserer konstruksjonen av et skreddersydd mikrorespirometrioppsett som kan brukes til å kvantifisere mengden oksygen som forbrukes og produseres av små fastsittende vannlevende organismer. De kritiske komponentene i denne protokollen inkluderer oppsett av kamrene, inkludert flekkene, og kalibrering av lavsignalet ved hjelp av respR-pakken , der et lavt signal kan defineres som hastigheter preget av grunne eller støyende skråninger. Det tilpassede kammeret og dets oppsett gjør det mulig å oppdage selv lave signaler, mens bruken av R-pakken bidrar til å beskytte mot problemer der forekomsten av grunne eller støyende skråninger kan føre til feiltolkning av resultatene (f.eks. falske positive).
Potensielle modifikasjoner som vil være nødvendige for andre brukere inkluderer sikring av organismen av interesse i det skreddersydde kammeret. I dette tilfellet ble det brukt en liten, stiv glidelås og akvariumlim for å feste den ene ungdommen til plastbasen, som deretter ble limt til slipset. Det skal bemerkes at korallungdommer for dette forsøket ble avgjort på svart plastplate. Denne plasten tillot enkel fjerning av korallungdommer, som effektivt gled av plasten, for ikke å skade dem fysisk under fjerningen. Korallungdommer festes til underlaget de legger seg på, så det anbefales å bosette dem på lignende plastmateriale, ved hjelp av et kunstig peptid16 for å lette fjerningen for limingsprosessen. For ytterligere å minimere håndteringsstress og innvirkning på respirasjonsresponsen, anbefales det å la korallene montert på glidelåsbånd akklimatisere seg i 1-2 uker, som er vanlig i mange voksne korallstresseksperimenter. Andre modifikasjoner kan være nødvendig for å sikre organismen over stedet i lokket og for å tillate vannsirkulasjon. Et annet viktig feilsøkingstrinn involverer signaldeteksjon, spesielt i helningen av oksygentidsserien der hastighetene skal bestemmes. Til syvende og sist kommer dette ned til en kombinasjon av å bruke god dømmekraft for å ekskludere åpenbart ustabile data, og funksjonene i respR for å tillate at priser trekkes ut fra enten konsekvent valgte regioner eller automatisk ved å identifisere lineære regioner av dataene. Ytterligere eksempler på hvordan du gjør dette er tilgjengelig på respR-nettstedet .
Denne metoden ble utviklet for å utvide målinger av den nedre grensen for respirasjon til ekstremt små, fastsittende marine virvelløse dyr. Den åpenbare begrensningen er at denne protokollen kan være mer utsatt for falske positive sammenlignet med protokoller designet for større biomasser. Men gitt at dette var poenget med designet for å måle disse nedre grensene, har dette blitt tatt med i designet, og prosedyren kan brukes med respR-pakken for bedre å beskytte mot falske positiver. Det er også viktig å erkjenne at det finnes andre systemer for måling av respirasjon30, og måling av små organismer, inkludert respirometri på individuelle hoppekreps31 i mindre volumer enn dette (~0,5-1 ml), men som enten er dyre eller mangler spesifikke komponenter (omrøringsevne). Imidlertid er dette systemet åpen kildekode og relativt lave kostnader sammenlignet med kommersielle systemer (f.eks. Core Microplate-system). Dette systemet inneholder også viktige metodiske hensyn som omrøring, som andre systemer kan mangle. Den interne omrøringsstangfunksjonen er avgjørende for å gjenskape den naturlige vannblandingen av mange marine organismer (f.eks. hoppekreps via svømming), som ofte ikke er mulig og kan gjøre dataene stort sett ubrukelige. I motsetning til dette involverer andre tilgjengelige blandingsmetoder å plassere hele respirometeret på en gigantisk vippebenk, noe som krever ekstra utstyr og har begrenset suksess i blanding eller blanding via vibrasjon, noe som kan forårsake forstyrrelse av organismen. Av denne grunn er dette det eneste systemet som kan utføre respirometri på juvenile koraller eller andre svært små fastsittende organismer. Til referanse varierte størrelsesområdet for prøvene som er inkludert her fra 2,1 til 3,6 polypper (tilsvarende bare noen få måneder gamle), med et minimum til maksimalt gjennomsnittlig areal på 1,3 til 4,5 mm2.
Respirometri er et grunnleggende tiltak i økologiske studier, og det finnes mange metoder for dette formålet. De fleste av disse eksisterende metodene retter seg imidlertid mot høye biomasseprøver, inkludert hel fisk, korallfragmenter eller sjøgress 32,33,34. Denne metoden er den første som bruker individuelle korallungdommer. I tillegg er det mange potensielle anvendelser for denne metoden, da den gir viktig fysiologisk informasjon om organismenes funksjon. Dette kan være viktig for studier som ønsker å karakterisere baseline helseestimater35, forstå rollen som akutt eller langvarig stress under korallontogeni som varmespenning36, eller å gi terskler som ledere kan sette for å beskytte og forbedre helsen til korallrev37. Gitt at korallen er en holobiont og symbiontsamfunnet er relativt fleksibelt på dette stadiet og gjennom det første år av livet38, ville det være interessant å parre respirometridata med endringer i samfunn over tid, for fullt ut å kontekstualisere organismenes funksjon som helhet. Det er viktig at denne metoden bidrar til "åpen vitenskap" -teknikker som bidrar til å gi en oversikt for å lage tilpassede eksperimentelle oppsett som kan deles, forbedres og standardiseres åpent.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Sam Noonan for hans hjelp og råd, Sven Uthicke for bruken av de første respirometrikamrene, Ben Shelab for hans tekniske illustrasjon og Australian Institute of Marine Science workshop for skreddersydd maskinering av respirometrikammeradaptere og holdere. Korallene ble samlet inn under følgende Great Barrier Reef Marine Park tillatelse til AIMS G12 / 35236.1. Koraller krever ikke etiske tillatelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cost | |||
| (1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
| 1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
| 1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
| 1.3 individual organism | NA | NA | NA |
| 1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
| 1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
| 1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
| 2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
| 3 computer | NA | NA | NA |
| 4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
| 5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
| 6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
| 8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
| 9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
| Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
| Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
| Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
| Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |
References
- Quigley, K. M. A fast, precise, in-vivo method for micron-level 3D models of corals using dental scanners. Methods in Ecology and Evolution. 13 (10), 2159-2166 (2022).
- Svendsen, M. B. S., Bushnell, P. G., Steffensen, J. F. Design and setup of intermittent-flow respirometry system for aquatic organisms. Journal of Fish Biology. 88 (1), 26-50 (2016).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates: a Manual for Scientists. , Oxford University Press. (2018).
- Carey, N., Harianto, J., Byrne, M. Sea urchins in a high-CO2 world: partitioned effects of body size, ocean warming and acidification on metabolic rate. The Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 8), 1178-1186 (2016).
- Clark, T. D., Sandblom, E., Jutfelt, F. Aerobic scope measurements of fishes in an era of climate change: respirometry, relevance and recommendations. The Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 15), 2771-2782 (2013).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Morris, L. A., Voolstra, C. R., Quigley, K. M., Bourne, D. G., Bay, L. K. Nutrient availability and metabolism affect the stability of coral-symbiodiniaceae symbioses. Trends in Microbiology. 27 (8), 678-689 (2019).
- Yellowlees, D., Rees, T. A. V., Leggat, W. Metabolic interactions between algal symbionts and invertebrate hosts. Plant, Cell & Environment. 31 (5), 679-694 (2008).
- Rädecker, N., et al. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9, 214 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Davy, S. K., Allemand, D., Weis, V. M.
- Weis, V. M. Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis. The Journal of Experimental Biology. 211 (Pt 19), 3059-3066 (2008).
- Baker, D. M., Freeman, C. J., Wong, J. C. Y., Fogel, M. L., Knowlton, N. Climate change promotes parasitism in a coral symbiosis. The ISME Journal. 12 (3), 921-930 (2018).
- Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Frontiers in Marine Science. 5, 227 (2018).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Beltran, V. H., Leggat, B., Willis, B. L. Experimental evolution of the coral algal endosymbiont, Cladocopium goreaui: lessons learnt across a decade of stress experiments to enhance coral heat tolerance. Restoration Ecology. 29 (3), e13342 (2021).
- Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Science Advances. 6 (20), eaba2498 (2020).
- Bieri, T., Onishi, M., Xiang, T., Grossman, A. R., Pringle, J. R. Relative contributions of various cellular mechanisms to loss of algae during cnidarian bleaching. PLoS One. 11 (4), e0152693 (2016).
- Tremblay, P., Gori, A., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Heterotrophy promotes the re-establishment of photosynthate translocation in a symbiotic coral after heat stress. Scientific Reports. 6, 38112 (2016).
- Tremblay, P., Grover, R., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Carbon translocation from symbiont to host depends on irradiance and food availability in the tropical coral Stylophora pistillata. Coral Reefs. 33 (1), 1-13 (2014).
- Wooldridge, S. A. Is the coral-algae symbiosis really 'mutually beneficial' for the partners. Bioessays. 32 (7), 615-625 (2010).
- Wooldridge, S. A. Breakdown of the coral-algae symbiosis: towards formalising a linkage between warm-water bleaching thresholds and the growth rate of the intracellular zooxanthellae. Biogeosciences. 10 (3), 1647-1658 (2013).
- Coles, S. L., Jokiel, P. L. Effects of temperature on photosynthesis and respiration in hermatypic corals. Marine Biology. 43, 209-216 (1977).
- Marubini, F., Davies, P. S. Nitrate increases zooxanthellae population density and reduces skeletogenesis in corals. Marine Biology. 127, 319-328 (1996).
- Iglesias-Prieto, R., Matta, J. L., Robins, W. A., Trench, R. K. Photosynthetic response to elevated temperature in the symbiotic dinoflagellate Symbiodinium microadriaticum in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10302-10305 (1992).
- Karako-Lampert, S., Katcoff, D. J., Achituv, Y., Dubinsky, Z., Stambler, N. Responses of Symbiodinium microadriaticum clade B to different environmental conditions. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 318 (1), 11-20 (2005).
- Blanckaert, A. C. A., Reef, R., Pandolfi, J. M., Lovelock, C. E. Variation in the elemental stoichiometry of the coral-zooxanthellae symbiosis. Coral Reefs. 39, 1071-1079 (2020).
- Harianto, J., Carey, N., Byrne, M. respR-An R package for the manipulation and analysis of respirometry data. Methods in Ecology and Evolution. 10 (6), 912-920 (2019).
- Gamble, S., Carton, A. G., Pirozzi, I. Open-top static respirometry is a reliable method to determine the routine metabolic rate of barramundi. Lates calcarifer. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 47 (1), 19-28 (2014).
- Burford, B. P., et al. Rapid range expansion of a marine ectotherm reveals the demographic and ecological consequences of short-term variability in seawater temperature and dissolved oxygen. The American Naturalist. 199 (4), 523-550 (2022).
- Morozov, S., McCairns, R. J. S., Merilä, J. FishResp: R package and GUI application for analysis of aquatic respirometry data. Conservation Physiology. 7 (1), coz003 (2019).
- Leclercq, N., Gattuso, J. -P., Jaubert, J. Primary production, respiration, and calcification of a coral reef mesocosm under increased CO2 partial pressure. Limnology and Oceanography. 47 (2), 558-564 (2002).
- Anthony, K. R. N., Hoegh-Guldberg, O. Variation in coral photosynthesis, respiration and growth characteristics in contrasting light microhabitats: an analogue to plants in forest gaps and understoreys. Functional Ecology. 17, 246-259 (2003).
- Moulin, L., et al. Long-term mesocosms study of the effects of ocean acidification on growth and physiology of the sea urchin Echinometra mathaei. Marine Environmental Research. 103, 103-114 (2015).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., van Oppen, M. J. H. Genome-wide SNP analysis reveals an increase in adaptive genetic variation through selective breeding of coral. Molecular Ecology. 29 (12), 2176-2188 (2020).
- Brunner, C. A., Ricardo, G. F., Uthicke, S., Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Effects of climate change and light limitation on coral recruits. Marine Ecology Progress Series. 690, 65-82 (2022).
- Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Torda, G., Bourne, D., Willis, B. L. Co-dynamics of Symbiodiniaceae and bacterial populations during the first year of symbiosis with Acropora tenuis juveniles. MicrobiologyOpen. 9 (2), e959 (2020).
- Quigley, K. M., Bay, L. K., Torda, G., Willis, B. L. Leveraging new knowledge of Symbiodinium community regulation in corals for conservation and reef restoration. Marine Ecology Progress Series, 600. , 245-253 (2018).
