Summary
Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.
Abstract
La microscopía electrónica es una de las herramientas necesarias para caracterizar las estructuras celulares. Sin embargo, el procedimiento es complicado y costoso debido a la preparación de la muestra para la observación. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de caracterización muy útil debido a su alta resolución en tres dimensiones y debido a la ausencia de cualquier requisito de vacío y conductividad de la muestra. AFM puede obtener imágenes de una amplia variedad de muestras con diferentes topografías y diferentes tipos de materiales.
AFM proporciona información topográfica 3D de alta resolución desde el nivel angstrom hasta la escala de micras. A diferencia de la microscopía tradicional, AFM utiliza una sonda para generar una imagen de la topografía de la superficie de una muestra. En este protocolo, se sugiere el uso de este tipo de microscopía para la caracterización morfológica y de daños celulares de bacterias fijadas en un soporte. Se utilizaron cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas hunanensis (aislada de muestras de bulbo de ajo). En este trabajo, las células bacterianas se cultivaron en medios de cultivo específicos. Para observar el daño celular, Staphylococcus aureus y Escherichia coli se incubaron con diferentes concentraciones de nanopartículas (NP).
Se fijó una gota de suspensión bacteriana en un soporte de vidrio, y se tomaron imágenes con AFM a diferentes escalas. Las imágenes obtenidas mostraron las características morfológicas de las bacterias. Además, empleando AFM, fue posible observar el daño a la estructura celular causado por el efecto de las NPs. A partir de las imágenes obtenidas, la AFM de contacto se puede utilizar para caracterizar la morfología de las células bacterianas fijadas en un soporte. AFM también es una herramienta adecuada para la investigación de los efectos de las NP en las bacterias. En comparación con la microscopía electrónica, AFM es una técnica económica y fácil de usar.
Introduction
Diferentes formas bacterianas fueron observadas por primera vez por Antony van Leeuwenhoek en el siglo 171. Las bacterias han existido en una gran diversidad de formas desde la antigüedad, que van desde esferas hasta células ramificadas2. La forma celular es una condición fundamental para que los taxónomos bacterianos describan y clasifiquen cada especie bacteriana, principalmente para la separación morfológica de filos grampositivos y gramnegativos3. Se sabe que varios elementos determinan las formas celulares bacterianas, todos los cuales están involucrados en las cubiertas y el soporte celular como componentes de la pared celular y la membrana, así como en el citoesqueleto. De esta manera, los científicos todavía están dilucidando los mecanismos y procesos químicos, bioquímicos y físicos implicados en la determinación de las formas celulares bacterianas, todos los cuales están definidos por grupos de genes que definen las formas bacterianas 2,4.
Además, los científicos han demostrado que la forma de bastón es probablemente la forma ancestral de las células bacterianas, ya que esta forma de célula parece óptima en parámetros significativos para las células. Por lo tanto, los cocos, la espiral, el vibrio, las formas filamentosas y otras se consideran adaptaciones a diversos entornos; De hecho, morfologías particulares han evolucionado independientemente varias veces, lo que sugiere que las formas de las bacterias podrían ser adaptaciones a ambientes particulares 3,5. Sin embargo, a lo largo del ciclo de vida de la célula bacteriana, la forma de la célula cambia, y esto también ocurre como una respuesta genética a condiciones ambientales dañinas3. La forma y el tamaño de la célula bacteriana determinan fuertemente la rigidez, robustez y relación superficie-volumen de las bacterias, y esta característica puede ser explotada para procesos biotecnológicos6.
La microscopía electrónica se utiliza para estudiar muestras biológicas debido al alto aumento que se puede alcanzar más allá de los microscopios basados en la luz. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) son las técnicas más utilizadas para este propósito; Sin embargo, las muestras requieren algunos tratamientos antes de ser colocadas en la cámara del microscopio con el fin de obtener imágenes apropiadas. Se requiere una cubierta de oro en las muestras, y el tiempo utilizado para la adquisición total de imágenes no debe ser demasiado largo. Por el contrario, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica ampliamente utilizada en el análisis de superficies, pero también se emplea en el estudio de muestras biológicas.
Existen varios tipos de modos AFM utilizados en el análisis de superficies, como el modo de contacto, el modo sin contacto o roscado, la microscopía de fuerza magnética (MFM), la AFM conductiva, la microscopía de fuerza piezoeléctrica (PFM), el roscado de fuerza máxima (PFT), la resonancia de contacto y el volumen de fuerza. Cada modo se utiliza en el análisis de materiales y proporciona información diferente sobre la superficie de los materiales y sus propiedades mecánicas y físicas. Sin embargo, algunos modos AFM se utilizan para el análisis de muestras biológicas in vitro, como PFT, porque PFT permite obtener datos topográficos y mecánicos sobre células en un medio líquido7.
En este trabajo, utilizamos el modo más básico incluido en cada modelo AFM antiguo y simple: el modo de contacto. AFM utiliza una sonda nítida (alrededor de <50 nm de diámetro) para escanear áreas de menos de 100 μm. La sonda se alinea con la muestra para interactuar con los campos de fuerza asociados con la muestra. La superficie se escanea con la sonda para mantener la fuerza constante. Luego, se genera una imagen de la superficie monitoreando el movimiento del voladizo a medida que se mueve a través de la superficie. La información recopilada proporciona las propiedades nanomecánicas de la superficie, como la adhesión, la elasticidad, la viscosidad y el cizallamiento.
En el modo de contacto AFM, el voladizo se escanea a través de la muestra con una desviación fija. Esto permite determinar la altura de las muestras (Z), y esto representa una ventaja sobre las otras técnicas de microscopio electrónico. El software AFM permite la generación de un escaneo de imagen 3D por la interacción entre la punta y la superficie de la muestra, y la desviación de la punta se correlaciona con la altura de la muestra a través de un láser y un detector.
En modo estático (modo de contacto) con fuerza constante, la salida presenta dos imágenes diferentes: la altura (topografía z) y la señal de deflexión o error. El modo estático es un modo de imagen valioso y simple, especialmente para muestras robustas en el aire que pueden manejar las altas cargas y las fuerzas de torsión ejercidas por el modo estático. El modo de deflexión o error se opera en modo de fuerza constante. Sin embargo, la imagen de la topografía se mejora aún más al agregar la señal de desviación a la estructura de la superficie. En este modo, la señal de deflexión también se conoce como señal de error, ya que la desviación es el parámetro de retroalimentación; Cualquier característica o morfología que aparezca en este canal se debe al "error" en el bucle de retroalimentación o, más bien, debido al bucle de retroalimentación requerido para mantener un punto de ajuste de deflexión constante.
El diseño único de AFM lo hace compacto, lo suficientemente pequeño como para caber en una mesa, al tiempo que tiene una resolución lo suficientemente alta como para resolver los pasos atómicos. El equipo AFM tiene un costo menor que el equipo para otros microscopios electrónicos, y los costos de mantenimiento son mínimos. El microscopio no requiere un laboratorio con condiciones especiales como una sala limpia o un espacio aislado; Solo necesita un escritorio libre de vibraciones. Para AFM, las muestras no necesitan someterse a una preparación elaborada como para otras técnicas (cubierta de oro, adelgazamiento); Solo se debe adjuntar una muestra seca al portamuestras.
Utilizamos el modo de contacto AFM para observar las morfologías bacterianas y los efectos de las NP. Se puede observar la población y la morfología celular de las bacterias fijadas en un soporte, así como el daño celular producido por las nanopartículas sobre las especies bacterianas. Las imágenes obtenidas por el modo de contacto AFM confirman que es una herramienta poderosa y no está limitada por reactivos y procedimientos complicados, por lo que es un método simple, rápido y económico para la caracterización bacteriana.
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Protocol
1. Aislamiento e identificación bacteriana
- Aislamiento de una cepa endófita de los meristemos del bulbo de ajo:
- Coloque fragmentos de 2 mm de meristemos de bulbos de ajo previamente pelados, desinfectados y cortados en agar de soja tripticasa (TSA) como un medio de crecimiento rico, e incubar a 25 ° C durante 1 día.
- Basándose en las diferencias morfológicas de las colonias bacterianas (forma, tamaño, color, borde, luz transmitida, luz reflejada, textura, consistencia y producción de pigmento), describa los diferentes morfotipos observados y purifique mediante rayas cruzadas una colonia representativa de cada morfotipo.
- Conservar todas las cepas bacterianas purificadas en glicerol al 30% a -80 °C.
- Identificar una cepa seleccionada al azar (9AP) secuenciando el ADNr 16S. Extraer el ADN siguiendo el método de Hoffman y Winston8.
- Amplificar el ARNr 16S mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con 100 ng de ADN, 1x tampón polimerasa, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol cada uno de oligonucleótidos universales 27F/1492r y 1 U de ADN polimerasa9. Utilice las siguientes condiciones del termociclador: 95 °C durante 5 min para la desnaturalización inicial; seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 °C como temperatura de desnaturalización, 1 min a 56 °C como temperatura de hibridación y 1 min a 72 °C como temperatura de extensión; y luego 10 min a 72 °C como extensión final.
- Secuencia capilar del producto de PCR utilizando los mismos oligonucleótidos; Utilice el método didesoxi-terminal con el kit de instalación de matriz para secuenciación capilar10, y realice electroforesis en un sistema multicapilar automatizado11.
- Edite manualmente las secuencias, compare la secuencia con la biblioteca GenBank usando una búsqueda BLAST e identifique tentativamente la cepa con el estándar de oro de al menos 98.7% de identidad con la especie más cercana12,13.
NOTA: La cepa 9AP fue identificada como perteneciente a la especie de Pseudomonas hunanensis, con una identidad del 99,86% con la secuencia para la cepa P. hunanensis LV (JX545210).
2. Preparación de muestras bacterianas para observación morfológica por AFM
- En condiciones estériles, coloque una gota de la suspensión bacteriana (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) en un portaobjetos de vidrio.
- Fijar las muestras en el portaobjetos mediante calentamiento en seco. Pase el portaobjetos suavemente sobre una llama varias veces hasta que la muestra esté seca.
NOTA: La fijación de muestras es una técnica rutinaria en microbiología para observar organismos procariotas fijos y simular su estructura como células vivas lo más cerca posible. - Coloque las muestras fijas en una placa de Petri y llévelas al equipo AFM para su observación.
NOTA: Como las muestras pueden verse alteradas por las condiciones climáticas a lo largo del tiempo, reserve un tiempo máximo de 24 h para el análisis en el equipo AFM. Mantenga las muestras libres de polvo.
3. Efecto antibacteriano de las nanopartículas de MgO contra las bacterias
NOTA: La síntesis y caracterización de NPs de MgO han sido publicadas previamente14. En este trabajo, la actividad antibacteriana de los nanomateriales fue estimada con base en el manual del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizando métodos de macrodilución y microdilución para la inhibición15,16.
- Estimación de la actividad inhibitoria mínima (CMI) y bactericidas (CMB)
- Precrecimiento de las cepas
- Inocular una cantidad apropiada de Escherichia coli o Staphylococcus aureus en caldo nutritivo para obtener una concentración final de 1 × 108 UFC/ml.
- Incubar la suspensión a 37 °C (± 2 °C) durante 18-24 h.
- Postcrecimiento de cepas aclimatadas
- Sumerja un bucle bacteriológico estéril en la suspensión, tocando el fondo del tubo.
- Realice rayas con el bucle en eosina y agar azul de metileno y agar nutriente.
- Incubar las placas de agar a 37 °C (± 2 °C) durante 24 h.
- Selección de colonias para la preparación del inóculo estandarizado.
- Tome de tres a cinco colonias con el mismo tipo morfológico tocando la parte superior de la colonia en la placa de Petri con un bucle bacteriológico.
- Transfiera y sumerja la selección en 3-5 ml de caldo Müller-Hinton.
- Incubar a 37 °C (± 2 °C) para lograr una turbidez de 1 × 10 8 UFC/ml o 2 × 108 UFC/ml.
NOTA: En este trabajo se utilizaron estándares de turbidez de McFarland como referencia para las suspensiones bacteriológicas; específicamente, el estándar 0.5 corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de E. coli de 1.5 × 108 células/mL. Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis para medir la turbidez. - Tome 1 ml y agréguelo a 9 ml de caldo estéril. Tomar 200 μL de esta dilución, y añadirlo a 19,8 ml de caldo estéril para obtener una concentración final de 5 × 105 UFC/ml.
- Concentraciones requeridas de nanopartículas de MgO
- Utilice un ultrasonido para la preparación de las soluciones.
- Suspender el nanomaterial en agua estéril al doble de la concentración requerida para obtener soluciones seriadas.
- Agregue estas suspensiones a tubos estériles que contengan caldo Müller-Hinton para lograr el nuevo rango de concentraciones requeridas para el experimento.
NOTA: Se aplicaron las siguientes concentraciones de MgO NPs para la microdilución: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm y 8,000 ppm.
- Preparación de la microdilución15
- Prepare una placa de microtitulación de 96 pocillos nueva y estéril (microplaca). Etiqueta columna Nº 12 de la microplaca como columna de esterilidad; etiqueta la columna Nº 11 como columna de control de crecimiento.
- Añadir 120 μL de las suspensiones de nanopartículas con las diferentes concentraciones a las columnas Nº 1-10.
- Inocular 120 μL de bacterias (5 × 105 UFC/ml) en los pocillos de las columnas Nº 1-10.
NOTA: Para este estudio, la fila G y la fila H fueron controles con ceftriaxona a concentraciones sugeridas por los estándares CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm, 0.125 ppm, 0.06 ppm y 0.03 ppm. - Incubar la microplaca de 96 pocillos durante 24 h a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Finalmente, analice los pozos.
- Precrecimiento de las cepas
- Observación de los cambios morfoestructurales inducidos por nanopartículas de MgO en las cepas bacterianas por AFM
- Tomar 250 μL de los pocillos de las pruebas de microdilución, mezclar con 750 μL de agua estéril y centrifugar a 2.000 × g de 2 min a 5 min a 5 °C.
- Lave los precipitados tres veces con 1 ml de agua estéril cada vez, y al final de los lavados, agrégueles 500 μL de agua.
- Para obtener las imágenes AFM, tomar 10-20 μL de la suspensión final de cada pozo de arranque, realizar un frotis en un portaobjetos previamente limpiado por ultrasonido (30 min), y secar a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Mediciones de AFM
NOTA: Aquí, el microscopio de fuerza atómica en modo de contacto se montó en una estación de trabajo antivibración que permitió el aislamiento del microscopio de cualquier fuente vibratoria mecánica y mantuvo el sistema nivelado. La interferencia eléctrica disminuye con filtros de línea y protección contra sobretensiones. El AFM utilizado aquí alinea automáticamente el rayo láser con el fotodetector.
- Encienda el ordenador y el AFM y, a continuación, seleccione el modo Contacto, las sondas contAI-G y las opciones Pendiente automática en las herramientas de software. Los valores predeterminados del controlador Z son Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10,000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 y Tip voltage = 0 mV.
- Coloque las muestras en el modo de contacto AFM utilizando un cabezal de rango de escaneo de 70 μm. Utilizamos voladizos de silicio ContAI-G con una constante de resorte de 0.13 N/m.
- Utilice un dispositivo de cámara montado en dos lentes integradas en el cabezal de escaneo para obtener una vista rápida de la superficie del área debajo de la sonda.
- Realice manualmente un desplazamiento en el plano XY para elegir el área deseada. La sonda se hace para acercarse electrónicamente a la muestra de superficie hasta que se alcanzan las condiciones de contacto. Ajuste electrónicamente el plano de medición XY del escáner y la superficie de la muestra reduciendo las pendientes en las direcciones XY.
- Utilice los parámetros estándar del software: 1 línea por segundo a 256 puntos por línea.
- Primero, realice un rango de escaneo completo de un área de 70 μm x 70 μm; A continuación, seleccione un área más pequeña con la herramienta Zoom. El AFM optimiza el rango del gráfico en Z automáticamente.
NOTA: Al disminuir las líneas por segundo, el tiempo total de escaneo aumenta, la calidad del escaneo está más definida y también se elimina algo de ruido de la medición. - Para seleccionar una nueva área de la muestra, retraiga el voladizo electrónicamente y mueva la muestra a lo largo del plano XY. Realice un nuevo análisis mediante el procedimiento descrito en los pasos 4.5 y 4.6.
NOTA: Los escaneos obtenidos se muestran en una escala de barras de un solo color, en la que los colores claros están asociados con altitudes más altas y los colores oscuros están asociados con altitudes más profundas. El software AFM genera una vista 3D del escaneo que permite la apreciación de los detalles de la superficie medida. - Realice el procesamiento de datos utilizando la nivelación línea por línea en el menú Herramientas de la imagen en la selección de filtro, que es el método de nivelación más utilizado y simple.
NOTA: Este método de nivelación toma cada línea horizontal o vertical producida en la imagen AFM y la ajusta a una ecuación polinómica. - Optimice la altura máxima y mínima en la barra de color de la derecha para obtener la mejor resolución de imagen.
- Realice el análisis de imagen mediante el menú Análisis de la barra de herramientas. Determine las alturas y distancias seleccionando los puntos inicial y final una vez seleccionada la herramienta deseada.
NOTA: Los usuarios deben probar los diferentes filtros del menú Herramientas para evitar artefactos de imagen de punta debido al acoplamiento utilizado en el proceso de nivelación. Los artefactos de imagen aparecen como líneas de raya y se muestran en algunas de las imágenes de AFM.
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Representative Results
Las imágenes de la morfología y el tamaño de las cepas de S. aureus y P. hunanensis , así como la organización poblacional de ambas cepas, se tomaron mediante microscopía de fuerza atómica en modo de contacto. Las imágenes de S. aureus mostraron que su población estaba distribuida por zonas con agregados de cocos (Figura 1A). Con un aumento en la escala, hubo una mayor apreciación de la distribución poblacional y la morfología de los cocos (Figura 1B). Los informes de microscopía mostraron que una estructura pseudo-hemisférica estaba presente en las células adyacentes de S. aureus, pero que en general, la bacteria presentaba una morfología esférica en forma de coco después de la división celular, como se mostró anteriormente en las imágenes de AFM. Además, las imágenes del modo de contacto AFM permitieron determinar el tamaño de los cocos, que mostraron un ancho promedio de 1,25 μm. Los valores obtenidos de la medición de 20 celdas se muestran en la Figura 2.
En el caso de P. hunanensis, se observó una distribución homogénea en toda la superficie del soporte vítreo, formando una monocapa bacteriana que se adhirió al soporte (Figura 3A), según lo informado por Zuttion et al., en el que los autores inmovilizaron P. aureginosa sobre un soporte sólido y mostraron el mismo comportamiento. Se observó que la bacteria Pseudomonas hunanensis tenía forma de bastoncillos, con una longitud de 1,9 μm (L) y una anchura de 0,9 μm (W) (Figura 3B,C); estos datos están dentro de los valores reportados para P. fluorescens de 1.5-2.0 μm (L) y 0.6-0.9 μm (W)17,18,19.
Para visualizar las alteraciones morfoestructurales debidas a la interacción de los NPs de MgO, las cepas bacterianas fueron sometidas a análisis AFM después del tratamiento (microdilución). Tres grupos se muestran en la Figura 4 y la Figura 5: la Figura 4A-C y la Figura 5A-C son los controles; las imágenes de la figura 4D-F y la figura 5D-F se obtuvieron a partir de los resultados de la microdilución en el MIC; las imágenes de la Figura 4G-I y la Figura 5G-I se obtuvieron a una concentración mayor que la MIC.
Las imágenes del grupo superior de la Figura 4A-C muestran una célula tipo coco de Staphylococcus aureus con una superficie lisa y contornos homogéneos, que creció en un ambiente adecuado en caldo de Müeller-Hinton durante 24 h según la técnica de microdilución. El diámetro promedio fue de 1 μm ± 0,15 μm. Este diámetro prácticamente desapareció después del tratamiento con NP, como se muestra en la Figura 4D-F, ya que el deterioro de la estructura celular fue muy severo. De acuerdo con la sección transversal, la altura promedio para el control fue de 200 nm ± 50 nm; La altura de las células tratadas se redujo en un 40% (120 nm ± 5 nm) en relación con los controles. Las imágenes muestran claramente cambios en la superficie, como la formación de vesículas, después de la exposición a MgO NPs en el CMI de las partículas; además, al duplicar las concentraciones, el estado interno de las estructuras celulares se vio afectado y se liberó material citosólico, como se muestra en las imágenes de la Figura4G-I 20,21.
Estos cambios también se identificaron en las células de E. coli, como se muestra en la Figura 5, con condiciones similares a S. aureus. Los controles de esta bacteria mostraron superficies lisas, destacando su forma muy homogénea en forma de bastón (bacilo) sin ninguna alteración aparente. Las imágenes tridimensionales muestran las regiones topográficas más altas asociadas con el microorganismo en blanco. La altura promedio de la E. coli control fue de 160 nm ± 50 nm, y de acuerdo con las imágenes transversales, la altura promedio disminuyó a 76 nm ± 10 nm para las células expuestas durante 24 h a una concentración de nanopartículas de MgO de 500 ppm (MIC). La estructura desapareció por completo a una concentración de 1.000 ppm, y solo se podían distinguir las siluetas de las bacterias. Al analizar las imágenes para ambas concentraciones, se observó que con respecto a los controles, la morfología celular de las células tratadas se alteró significativamente, con un alargamiento de 2.0 μm ± 0.5 μm (Figura 5A-C) a 3.0 μm ± 0.3 μm, como se muestra en las imágenes de la Figura 5D-I. Este aumento fue evidente cuando la estructura celular estaba perdiendo homeostasis interna, causando colapso estructural20,22. Las imágenes de bacterias expuestas a NPs de MgO mostraron claramente cambios superficiales como formación de crestas o ondulaciones formando alteraciones vesiculares tanto en las CMI como al duplicar las concentraciones20,22.
Figura 1: Modo de contacto con microscopía de fuerza atómica para Staphylococcus aureus. Esta figura muestra las topografías tomadas de S. aureus a diferentes escalas: (A) 70 μm y (B) 5,0 μm. Las áreas cartográficas fueron elegidas para obtener la topografía de S. aureus ; la imagen B muestra claramente S. aureus cocci. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Topografías e histogramas de modo de contacto de microscopía de fuerza atómica de Staphylococcus aureus. La imagen muestra la (A) topografía y (B) histograma de los diámetros de la bacteria S. aureus fijada en un soporte de vidrio utilizando el procedimiento de fijación de calor. El diámetro de la celda se midió con el software AFM; n = 20. La imagen es una representación de la medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Modo de contacto por microscopía de fuerza atómica para Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Esta figura muestra las topografías tomadas de P. hunanensis 1AP-CY a diferentes escalas: (A) 70 μm, (B) 20 μm y (C) 5.0 μm. Las imágenes a diferentes escalas muestran la distribución de la población celular en la diapositiva. Para analizar la morfología celular, se enfoca un área con una densidad de población menor, como se muestra en la imagen B, que muestra la forma de bastón de P. hunanensis (se muestra la señal de desviación para mejorar la imagen topográfica). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes de modo de contacto AFM obtenidas para S. aureus (arriba) y S. aureus no tratados expuestos a nanopartículas de MgO de 250 ppm y 500 ppm (medio e inferior) durante 24 h. (A, D, G) Imágenes topográficas; (B,E,H) imágenes tridimensionales; (C,F,I) imágenes transversales. Se observaron cambios estructurales en las bacterias al emplear la concentración inhibitoria mínima de MgO (250 ppm) y una concentración más alta (500 ppm). La señal de desviación se muestra para mejorar la imagen de la topografía. Las figuras 4A,D,G son de Muñiz Díaz et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de modo de contacto AFM obtenidas para E. coli (arriba) y E. coli no tratadas expuestas a nanopartículas de MgO de 500 ppm y 1.000 ppm (media e inferior) durante 24 h. (A,D,G) Imágenes topográficas; (B,E,H) imágenes tridimensionales; (C,F,I) imágenes transversales. Se observaron cambios estructurales en las bacterias al emplear la concentración inhibitoria mínima de MgO (500 ppm) y una concentración más alta (1.000 ppm). Las figuras 5A,D,G son de Muñiz Díaz et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La microscopía es una técnica comúnmente utilizada en laboratorios biológicos que permite la investigación de la estructura, tamaño, morfología y disposición celular de muestras biológicas. Para mejorar esta técnica, se pueden utilizar varios tipos de microscopios que difieren entre sí en cuanto a sus características ópticas o electrónicas, que determinan la potencia de resolución del instrumento.
En la investigación científica, se requiere el uso de microscopía para la caracterización de células bacterianas; por ejemplo, la microscopía ha demostrado que NaCl influye en la resistencia térmica y la morfología celular de las cepas de E. coli, el extracto de Schisandra chinensis muestra efectos antibacterianos hacia S. aureus, S. aureus desarrolla termotolerancia después de un choque térmico subletal y E. coli biomineraliza el platino 23,24,25,26,27 . Así, las ventajas presentadas por AFM han permitido su expansión a las áreas de investigación de medio ambiente y biología.
El microscopio de fuerza atómica es un instrumento utilizado en modo de contacto para analizar bacterias in situ y en modo sin contacto para determinar la topografía de materiales macro y nanoscópicos. La ventaja de AFM sobre otras técnicas es que requiere menos muestras para obtener imágenes topográficas; También se considera una técnica no destructiva, y no daña ni compromete la estructura de la imagen analizada. Aunque utilizamos la fijación térmica en este protocolo, la morfología celular bacteriana no se alteró. Es importante mencionar que esta técnica es comúnmente utilizada en el laboratorio de microbiología para estudiar morfologías bacterianas. A diferencia de las muestras de tejido vegetal y animal, la técnica de fijación por calor produce cambios en las proteínas y lípidos que se manifiestan en el deterioro del tejido; En las bacterias, la técnica causa una ligera contracción de la célula que no interfiere con la observación de la forma e identificación celular.
Con AFM, la preparación de la muestra es fácil y no requiere ningún producto químico, como en el caso de la microscopía electrónica, donde es esencial que la muestra a analizar sea conductora, ya que la imagen se produce por la interacción de los electrones emitidos por el equipo y la muestra. Si la muestra no es conductora, debe ser metalizada con un elemento conductor como el oro mediante la técnica de deposición física de vapor. Además, la resolución de la microscopía electrónica alcanza hasta 0,4 nm, dependiendo de la lente y el modelo, mientras que la AFM en modo de contacto puede alcanzar una resolución micrométrica, nanométrica o incluso piceura, lo que la hace competitiva con la microscopía electrónica22. Otra ventaja de AFM sobre la microscopía electrónica es que no requiere condiciones de alto vacío para el procesamiento de muestras20,21. Otras ventajas de AFM sobre las técnicas comúnmente utilizadas son el bajo costo y el corto tiempo de adquisición de imágenes.
Con respecto a la técnica de fijación de la muestra bacteriana a una placa de vidrio, es importante mencionar que la fijación térmica es una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios de microbiología. Esta técnica se utiliza para que las muestras bacterianas puedan identificarse mediante tinción simple o diferencial. Al mismo tiempo, se puede ver la forma de las bacterias, comúnmente cocos o bastones. Una desventaja de la técnica de fijación de calor es la disminución en el tamaño de las bacterias, pero esta técnica no compromete la forma de las bacterias.
Después de la fijación, se debe tener cuidado para evitar el envejecimiento de la muestra, que puede manifestarse como una disminución significativa en el tamaño de la célula; Por lo tanto, es aconsejable analizar la muestra dentro de las 24 h posteriores a la fijación. También se debe tener cuidado para garantizar que la muestra no esté expuesta al polvo; Por lo tanto, las muestras deben mantenerse en un recipiente cerrado (por ejemplo, una placa de Petri). Estas condiciones son críticas ya que pueden alterar las imágenes AFM obtenidas.
Está claro que la disminución del tamaño de las bacterias puede afectar algunos trabajos de investigación, así como que pueden ser necesarias otras formas de unir las bacterias a un soporte. Por ejemplo, las biopelículas de S. aureus cultivadas en caldo BM en placas de 34 mm se han fijado con gliceraldehído. Además, S. aureus ha sido inmovilizado con voladizos en forma de V tratados con poli-l-lisina, mientras que para C. albicans, las hifas han sido fijadas en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina cargada positivamente con el fin de analizar el intercambio de proteínas séricas adsorbidas durante la adhesión de ambas a una superficie abiótica28,29.
En este trabajo, la fijación térmica de las muestras no alteró la forma o los agregados formados por las bacterias, y la fijación por calor permitió visualizar el efecto de las nanopartículas. Por lo tanto, las topografías AFM podrían mostrar la forma de los cocos aislados o agregados de S. aureus y las varillas de P. hunanensis (Figura 1 y Figura 3). Además, también encontramos que S. aureus y E. coli mostraron daños en sus estructuras debido al efecto de las nanopartículas de MgO, mientras que las muestras control (sin nanopartículas) no mostraron ninguna alteración en su morfología (Figura 4 y Figura 5).
Este trabajo demuestra que el uso del modo de contacto AFM es una alternativa viable para caracterizar la topología superficial y los defectos de las muestras biológicas, como se ha demostrado con S. aureus, P. hunanensis y E. coli. Además, la técnica de fijación térmica no es un factor determinante que altere la superficie celular e impida el análisis. Modestamente, podemos sugerir que la fijación térmica puede ser una ventaja en el uso de AFM. Las muestras se procesan menos y se evita el uso de reactivos químicos. Por lo tanto, la metodología es una técnica simple y económica. Vale la pena mencionar que esto puede cambiar dependiendo del análisis específico a realizar, como se muestra para el estudio de biofilms y adhesión bacteriana28,29. Como una posible extensión de este trabajo, el modo de contacto AFM podría usarse para analizar el efecto de las NP en otras bacterias médicamente importantes o en investigaciones en las que se debe observar daño celular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Ramiro Muñiz-Díaz agradece al CONACyT por la beca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
