Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.
Abstract
Typ-1-Diabetes ist gekennzeichnet durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Eine vielversprechende Behandlung für diese Krankheit ist die Transplantation von Betazellen aus Stammzellen. Genetische Veränderungen können jedoch notwendig sein, um die transplantierten Zellen vor anhaltender Autoimmunität zu schützen. Diabetische Mausmodelle sind ein nützliches Werkzeug für die vorläufige Evaluierung von Strategien zum Schutz transplantierter Zellen vor Autoimmunangriffen. Hier wird ein minimalinvasives Verfahren zur Transplantation und Bildgebung von Zelltransplantaten in einem adoptiven Transfermodell von Diabetes in Mäusen beschrieben. In diesem Protokoll werden Zellen aus der murinen Pankreas-Betazelllinie NIT-1, die das Glühwürmchen-Luciferase-Transgen luc2 exprimieren, subkutan in immundefizige, nicht-adipöse diabetische (NOD)-schwere kombinierte immundefiziente (scid) Mäuse transplantiert. Diesen Mäusen werden gleichzeitig Splenozyten von spontandiabetischen NOD-Mäusen intravenös injiziert, um Autoimmunität zu übertragen. Die Transplantate werden in regelmäßigen Abständen mittels nicht-invasiver biolumineszenter Bildgebung abgebildet, um das Überleben der Zellen zu überwachen. Das Überleben von mutierten Zellen wird mit dem von Kontrollzellen verglichen, die in dieselbe Maus transplantiert wurden.
Introduction
Typ-1-Diabetes (T1D) wird durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht. Der Verlust von Betazellmasse führt zu Insulinmangel und Hyperglykämie. T1D-Patienten sind auf mehrere tägliche Injektionen von exogenem Insulin angewiesen und leiden im Laufe ihres Lebens unter Episoden schwerer Hyperglykämie und Hypoglykämie. Zu den Komplikationen, die mit diesen Episoden verbunden sind, gehören diabetische Retinopathie, verminderte Nierenfunktion und Neuropathie1.
Insulininjektionen sind eine Behandlung, aber keine Heilung für T1D. Der Ersatz der verlorenen Betazellmasse hat jedoch das Potenzial, die Krankheit rückgängig zu machen, indem die Patienten in die Lage versetzt werden, ihr eigenes Insulin zu produzieren. Das Angebot an Leichenspenderinseln ist jedoch begrenzt2. Aus Stammzellen gewonnene Inseln (SC-Inselchen) können einen praktisch unbegrenzten Vorrat an Betazellen für die Transplantation bieten. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) differenziert werden können, um funktionelle beta-ähnliche Zellen zu erzeugen 3,4,5. Vielversprechende frühe klinische Studiendaten deuten darauf hin, dass diese Zellen ihre Funktion nach der Transplantation beibehalten und es den Patienten ermöglichen könnten, insulinunabhängig zu werden6. Es ist jedoch eine chronische Immunsuppression erforderlich, die ihre Anfälligkeit für Krebs und Infektionen erhöht. Darüber hinaus können Immunsuppressiva langfristig zytotoxisch für Transplantate sein7. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu eliminieren, können SC-Inseln genetisch verändert werden, um sie vor rezidivierender Autoimmunität sowie Alloimmunität nach der Transplantation zu schützen.
Die Stammzellforschung ist sehr kosten- und arbeitsintensiv. Mauszelllinien und Tiermodelle sind nützliche Werkzeuge für die erste Identifizierung und experimentelle Validierung von Strategien zum Schutz transplantierter Zellen vor Autoimmunität. Die NOD-Maus entwickelt einen spontanen Autoimmundiabetes mit vielen Ähnlichkeiten zu humanem T1D8, und die NIT-1-Insulinom-Zelllinie teilt einen genetischen Hintergrund mit diesem Mausstamm9. Diabetes kann durch die Injektion von diabetischen Milzzellen aus NOD-Mäusen adoptativ auf den verwandten immundefizienten NOD-scid-Mausstamm übertragen werden, um den Ausbruch des Diabetes in replizierten Versuchsmäusen zeitlich zu synchronisieren10. Mit diesem Modell lassen sich relativ schnell und kostengünstig genetische Zielstrukturen für die weitere Validierung in SC-Inseln identifizieren. Kürzlich wurde die Methode zur Identifizierung und Validierung von RNLS angewendet, einem Ziel, das primäre menschliche Inseln in vivo vor Autoimmunität und aus iPS-Zellen gewonnene Inseln vor Betazellstress in vitroschützt 11. Hier wird ein einfaches Protokoll beschrieben, um gentechnisch veränderte NIT-1-Zellen zu transplantieren und ihr Überleben nicht-invasiv in einem adoptiven Transfermodell für Autoimmundiabetes bei Mäusen zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D ist eine verheerende Krankheit, für die es derzeit keine Heilung gibt. Die Betazellersatztherapie bietet eine vielversprechende Behandlung für Patienten mit dieser Krankheit, aber das entscheidende Hindernis für diese Strategie ist das Potenzial für wiederkehrende Autoimmunangriffe gegen die transplantierten Betazellen. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist die gentechnische Veränderung von SC-beta-Zellen, um deren Immunsichtbarkeit oder -anfälligkeit zu verringern. Hier wird ein Protokoll für die nic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Erica P. Cai und Dr. Yuki Ishikawa für die Entwicklung der in diesem Protokoll beschriebenen Methode (siehe Ref. 11). Die Forschung in den Labors von S.K. und P.Y. wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, des Harvard Stem Cell Institute und der Beatson Foundation unterstützt. T.S. wurde durch ein Postdoc-Stipendium des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45) unterstützt, und K.B. wurde teilweise durch ein Stipendium der Mary K. Iacocca Foundation unterstützt.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
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